耐利福平与基因突变

第一节　耐利福平与rpoB基因突变

利福平（rifampin，RFP）是一种快速全效杀菌剂，为重要的一线抗结核药物，是当前短程抗结核化疗的基础。早在1959年，即从Strepbmyces mediterranei的培养液中得到多种成分的抗生素利福霉素（A-E），通过化学改造，1965年，从其衍生物中合成了利福平，属半合成抗生素。作为亲脂性抗生素，RFP能迅速透过疏水性的细菌胞膜，与结核杆菌的RNA聚合酶β亚单位以非共价键结合，抑制该酶的活性，在转录水平上发挥抗菌作用。

当前，对结核分枝杆菌利福平耐药机制的研究是建立在对大肠杆菌依赖DNA的RNA聚合酶的研究之上。 RNA聚合酶是由4个不同的亚单位（α、β、β′、δ）组合而成的单链复合体。 4条链组成的核心酶（α2ββ′）具有聚合酶活性，并和另一个能特异启动转录的δ因子一起组成全酶（α2ββ′δ）。编码α、β、β′和δ亚单位的基因分别称为rpoA、rpoB、rpoC和rpoD。1983年，Wehrli进行了聚合酶亚单位重组试验，结果表明：含αβ′亚单位的利福平耐药菌株和含β亚单位的利福平敏感菌株的聚合酶对利福平敏感；含αβ′亚单位的利福平敏感菌株和含β亚单位的利福平耐药菌株的聚合酶对利福平耐药。因此，只有β亚单位与RNA聚合酶与利福平的耐药性相关。同时，也进一步说明了RNA聚合酶的β亚单位为利福平的靶位点，利福平通过结合于RNA聚合酶的β亚单位上，导致结核杆菌转录时RNA合成起始受阻，抑制了菌蛋白合成，从而表现为抑菌效应。编码β亚单位的基因rpoB即为靶编码基因。

1985年，Yamada等进一步揭示结核杆菌RFP耐药株的DNA依赖性RNA聚合酶发生了改变，使得药物不能与之结合，从而导致RFP丧失抗菌作用。

1988年，Jin和Gross分离到42株自发性产生的大肠杆菌RFP耐药株，序列分析显示大肠杆菌RFP耐药株的β亚单位结构基因rpoB出现17种突变，涉及到14种氨基酸改变。为了验证所检测的突变与RFP相关，运用等位基因交换技术，将相应rpoB突变基因转入pBR322质粒，并可使敏感的大肠杆菌发生耐药性表型的改变。

1993年，Telenti等首先应用PCR扩增了结核杆菌一个411bp片段，对应于结核杆菌380位到516位氨基酸（相当于大肠杆菌的455位到591位氨基酸），结果66株RFP耐药株中64株基因突变，2株RFP耐药株未检出突变，56株RFP敏感株均未检出基因突变，耐药株的突变共有15种，涉及8种氨基酸。

1994年，Mi11er等将结核杆菌敏感株rpoB基因引入穿梭载体pMV261，并电穿孔转化到高耐药耻垢分枝杆菌菌株LR223，可降低耐药株耐药水平；进一步应用PCR诱变技术造成结核杆菌rpoB456位氨基酸（相当于大肠杆菌的531位氨基酸）突变，并电穿孔转化到敏感型耻垢分枝杆菌菌株LR222，则使之发生耐药表型改变，由RFP敏感株转变为耐药株。证实了rpoB是造成RFP耐药的原因。

近几年，从结构生物学方面对RFP耐药的机制进行了研究，Campbell等（2001年）对嗜热菌RNA聚合酶核心区和RFP的复合体结晶进行分析，结果显示，RFP可以和位于DNA/RNA与通道深处的RNA聚合酶β亚单位的一个距酶活性中心12A的带状结构相结合，因而在RNA转录合成2～3个核苷酸长度时即可直接阻止RNA链的延伸。

虽然，目前已把rpoB突变作为结核杆菌耐RFP的遗传标志，但rpoB突变并不能完全解释结核杆菌对RFP产生耐药性的分子机制。例如，尚有5%左右的耐RFP结核杆菌未能在rpoB突变热点区检出突变；已检测出的rpoB基因突变多达20余种，这些突变是否均能改变RNA聚合酶空间构象，继而导致耐药性还未能完全阐明；特别是与结核杆菌同属的鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌和耻垢分枝杆菌对RFP的耐药性与rpoB基因并无关联，提示还可能存在尚未发现的RFP耐药机制。

可能存在结核杆菌耐RFP机制包括：在rpoB核心突变区之外的位置发生突变，在大肠杆菌的RFP耐药的研究中即发现rpoB核心突变区之外的位置发生突变； RNA聚合酶其他亚基的突变；影响RFP渗透性的细菌胞膜改变等等。因此，有关结核杆菌RFP耐药机制的研究还有待于进一步加深。