共聚焦显微镜的发展历史和背景

第一章　共聚焦显微镜的发展历史和背景

1955年,Marvin Minsky等首先提出了共聚焦显微镜的概念,并将其用于研究活体脑组织中的神经网络。它的原理是利用聚光镜将光线聚焦到神经组织的很小范围内,同时将显微镜的物镜也准确聚焦在同一位置。由于聚光镜和物镜的焦点是相同的,所以这种显微镜被称为共聚焦显微镜。此后,Wilson和Sheppard等对其光学理论作了进一步的发展。 1974年,Maurice首次将共聚焦光学理论应用于眼科领域,其主要发明是角膜内皮镜原型。而后,Bourne和Koester等对其作了进一步的改进,并最终得到了可用于临床的角膜内皮镜。角膜内皮镜目前仍在眼库、眼科辅助检查等临床实践中广泛应用。但是,角膜内皮镜也有缺点。由于角膜内皮镜使用较宽的扫描裂隙检测器(500μm)代替衍射限制的点状(20μm)或裂隙状光源,并且光线被物镜分为两条路径(入射光/检测器),所以这种仪器虽然可以获得较大范围内的图像,但是图像的水平和轴向分辨率比使用相同有效光圈数量物镜的共聚焦显微镜要小得多。

1994年,Master和Thaer等报道的可用于对活体角膜进行可变裂隙、实时、非接触型观察的角膜共聚焦显微镜具有里程碑式的意义。经过10余年的发展,目前,眼科临床型共聚焦显微镜已发展得比较成熟,在角膜的病理、生理、创伤愈合及疾病诊断方面都具备以往其他检查设备无可比拟的优势。

现代临床中应用于角膜成像的共聚焦显微镜是将点状或裂隙状(即光的衍射极限)光源,聚焦到活体角膜很小的一个体积范围内,同时使用一个共聚焦的点状(小孔)或者裂隙状探测器来接受信号(图1-1)。与此同时,经过光学校准可以排除或减少物镜所确定的聚焦平面(或体积)以上或以下的离焦反射信号,从而使得横断面(x、y轴)和轴向(z 轴)的分辨率和对比度均有明显提高(图1-2)。尽管聚焦区域内的分辨率获得明显提高,但是每个点状或裂隙状光源探测器每次观察到的聚焦区域也仅仅是角膜的很小一部分,所以仪器必须通过快速扫描以获得更大的观察野,以利于从整体上对角膜进行观察。上述过程的实现有赖于照明装置和检测装置的同步运动。值得一提的是,操作者在角膜上通过沿z轴方向改变光源和检测器的聚焦平面,不需要移动就可获得非侵袭性观察角膜光学切面。这种情况使得操作者能在足够大的放大倍数下原位观察角膜的正常结构及其病理生理过程,实现对细胞和亚细胞结构进行四维动态观察(x、y、z轴和时间)。

图1-1　共聚焦显微镜成像原理

注:激光光束通过一个光扫描装置(2)和一个凸镜后聚焦在角膜表面上,然后光线从角膜表面反射,通过光线分离器(1)聚焦在目镜上。如果光线聚焦在角膜基质内(3),则反射到目镜的图像需要通过一个小孔镜(5)进行聚焦。如光线在物镜焦距以外的范围(4),则图像不能在目镜上成像

图1-2　共聚焦显微镜裂隙扫描成像过程

注:光线通过一个带有很多小孔镜的Nipkow旋转盘(2)后,经物镜聚焦在观察的样本上,反射光线直接被一个光分离器(1)反射到Nipkow盘的另一侧相同孔径内(3),并聚焦在目镜上

目前应用于眼科临床的共聚焦显微镜均属于实时、无创的裂隙光扫描共聚焦显微镜。与早期的共聚焦显微镜相比,有两大明显的优势:①通过连续调整裂隙,从而调节焦点在z轴的深度,可以使信噪比达到最大,从而保证组织深度增加时光学切面影像仍有较高的对比度;②使用裂隙光源可得到较强的信号,当联合使用有效光圈数较高的物镜时,可通过调整裂隙连续获得共聚焦点,进而得到高清晰度的视频影像。由此,共聚焦显微镜可以实现对活体组织超微结构的无创性观察。

(乐琦骅　洪佳旭　孙兴怀)

参考文献

1. Bourne WM, McCarey BE, Kaufman HE. Clinical specular microscopy. Trans Am Acad Ophthalmol Otdaryngol, 1976, 81:743～753

2.Cavanagh HD,Jester JV, Essepian J,et al.Confocal microscopy of the living eye. CLAO J, 1990, 16:65～73

3. Jester JV, Andrews PM, Petroll WM, et al. In vivo, real-time confocal imaging. J Electron Microsc Tech, 1991, 18(1):50～60

4. Koester CJ. Scanning mirror microscope with optical sectioning characteristics:applications in ophthalmology. Appl Optics, 1980, 19:1749～1757

5. Master BR, Thaer AA. Real-time scanning slit confocal microscopy of the in vivo human cornea. Appl Optics, 1994, 33:695～701

6. Maurice DM. A scanning slit optical microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1974, 13:1033～1037

7. Minksy M. Memoir on inventing the confocal scanning microscope.Scanning, 1988, 10:128～138

8. Petroll WM, Jester JV, Cavanagh HD. In vivo confocal imaging: general principles and applications. Scanning, 1994, 16(3):131～149

9. Wilson T, Sheppard C. Theory and practice of scanning optical microscopy. London: Academic Press, 1984