基因工程菌的发酵控制

近年来，基因工程已开始由实验室走向工业生产，一些珍稀药物如胰岛素、干扰素、人生长激素等已先后面市，但从许多研究中发现，基因重组菌的培养与发酵有其自身的特点。从培养工程的角度应考虑诸如营养源浓度的控制（碳源、氮源等）、最适生长条件的控制等因素；从生物学上应考虑诸如质粒稳定性的控制、质粒拷贝数的控制、转录效率和翻译效率的提高及代谢产物向菌体外的分泌等主要因素。

1.营养源浓度的控制

由于大多数基因重组菌不能把所需的基因产物分泌到胞外，而只能靠破碎细胞后提取，因此要获得基因产物，首先必须得到大量菌体。为此基因重组菌的发酵一般采用高浓度菌体培养的方法，如大肠杆菌培养时最高可达125g干菌体／L发酵液，酿酒酵母可达145g干菌体／L发酵液。但要得到高浓度菌体，必须要提供高浓度的营养物质，而营养源浓度过高，渗透压也就高，反过来又会抑制重组菌的生长。此外，许多基因重组菌常是维生素或氨基酸的营养缺陷型菌株，为维持菌体生长，也必须添加必需量的生长因子营养物。常采用在调节pH的同时补加氨基酸混合液和葡萄糖的方法，使整个培养期间，葡萄糖和氨基酸的浓度几乎保持恒定，菌体持续以最高生长速度生长，得到高浓度菌体。

2.质粒的不稳定性及其控制

在重组菌工业化生产过程中，质粒的不稳定性是一个极为重要而独特的问题。带有质粒的细胞生长较慢，生长速率与所带质粒的大小成反比。此外，高水平克隆基因产物的生成也会导致生长缓慢或生长异常（表达越高，生长越慢）。由于质粒的不稳定性，在繁殖传代过程中还会有一部分细胞部分甚至完全丢失质粒，导致所需产物的产量下降。

质粒不稳定包括分离性不稳定和结构性不稳定两种类型。前者是细胞分裂过程中质粒没有分配到子细胞中而导致整个质粒的丢失；后者是由于重组质粒DNA发生缺失、插入或重排而引起的质粒结构变化。

为了在工业化生产时使质粒的丢失降低到最低程度，除了在构建合适的重组菌外，还应对重组菌进行一系列发酵试验，以选择最佳的发酵条件。在发酵过程中可以通过以下方法来增加质粒的稳定性：

（1）施加选择压力

利用某些生长条件，只让那些具有一定遗传特性的细胞才能够生长。在重组菌发酵时，常采取这种方法来消除重组质粒的不稳定性，以提高菌体纯度和发酵生产率。

1）抗生素添加法。因重组菌中常含有抗药性基因，因此可添加相应的抗生素来限制非重组菌的生长。但由于抗生素的存在往往在一定程度上会影响目的产物的合成，增加产物提取的难度，而且对一些易被酶水解失活的抗生素来说，添加抗生素所造成的选择压力只能维持一定的时间。如带Ampr基因的克隆株在氨苄青霉素浓度为50、200、1000μg／mL的培养基中培养16h后，含有重组质粒的细胞数占总细胞数的比例分别为40％ 、60％和100％ ，再加上发酵过程中受成本的限制，所以大规模生产时此法并不可取。

2）抗生素依赖型变异法。通过诱变使受体细胞成为某抗生素的依赖型突变株，即只有在该抗生素存在时受体细胞才能生长，而重组质粒上含有该抗生素的非依赖基因，将重组质粒导入后，克隆菌能在不含抗生素的培养基中生长。此方法可节约大量抗生素，但克隆菌易发生回复突变。

3）营养缺陷型法。受体细胞是营养缺陷型的，不能在选择性培养基上生长，而质粒中含有此基因，克隆后克隆株能在选择性培养基上生长。如构建带色氨酸操纵子的重组质粒pBR322-trp，在质粒上插入serB基因，而受体细胞是serB缺陷型的，因此只有重组菌才能在不含Ser的培养基上生长。

（2）控制基因过量表达

由于外源基因表达水平越高，重组菌往往越不稳定。因此一般采用两阶段培养法，即在发酵前期控制外源基因不过量表达，使重组质粒稳定地遗传；到后期，通过提高质粒的拷贝数或转录翻译效率，使外源基因高效表达。

1）可诱导启动子。在构建表达质粒时，可以使用可诱导的操纵子，如lac，trp等。在用含有这些启动子的克隆菌进行发酵生产时，可以选择培养条件使启动子受阻遏至一定时期，在此期间质粒稳定地遗传，然后通过去阻遏（诱导），使质粒高效表达，例如利用β-吲哚乙酸可以使trp启动子去阻遏。

2）温度敏感型质粒。某些质粒在温度较低时，质粒拷贝数少，温度升高后，大量扩增，这种质粒称“脱缰质粒”（runaway plasmid），如p KN402和p KN410在30℃时拷贝数为20～50个／大肠杆菌细胞，而35℃时大量复制。若将β-内酰胺酶基因接在此质粒中，经热诱导后，β-内酰胺酶活力可增强400倍。

（3）控制培养条件

1）培养基组成。不同的培养基能影响微生物的代谢活动，也能影响质粒的稳定性。有人认为质粒在丰富培养基中比在最低限量培养基中更加不稳定。

2）培养温度。含有重组质粒的克隆菌的比生长速率往往比受体菌要小，同样质粒导入受体菌后会使受体菌的生长温度改变。通常而言，低温有利于重组质粒稳定地遗传。

3）菌体比生长速率。调整重组菌及受体菌的比生长速率可以提高重组质粒的稳定性，但要做到这一点非常困难，因为大多数环境条件可同时提高或降低这两种菌的比生长速率。在某些情况下，可以利用分解代谢物阻遏来控制菌的比生长速率，来提高重组质粒的稳定性。如在重组质粒中克隆入抗高浓度阻遏的某个基因，这样在进行高浓度底物培养时，受体菌被抑制，比生长速率下降，而重组菌仍能正常生长。

综上所述，选定一个合适的受体菌十分重要。基因工程操作中常用的受体菌是大肠杆菌，它最大的缺点是代谢产物很难分泌出胞外，让枯草芽孢杆菌把代谢产物分泌出来是可能的，但由于产芽孢，难于培养到高浓度，而不产芽孢的变易株又往往很难培养，因此应该适当考虑用其他微生物作受体。

为了高效率地生产代谢产物，还应考虑每个细胞的质粒数、质粒的稳定性及转录和翻译的效率等。质粒越多，产量越高，但增殖速度越慢，质粒脱落的速度越快；表达水平越高，重组质粒越不稳定。因此在实际生产中可考虑用两阶段培养方式，第一阶段主要考虑增殖，第二阶段主要考虑目的基因的表达。也可通过改变温度、用双罐连续培养等方式，或用添加或去除药剂的方法来提高基因产物的产量。

3.工程菌外逸的控制

由构建的工程菌所携带的转入基因对于环境的长期安全性仍具有风险性，目前有关法规都明确规定工程菌不能扩散到自然环境中，因此应采取以下措施以防菌体外逸。

（1）排气控制。排出的气中含有大量气溶胶，在剧烈起泡的培养物中，培养液呈泡沫状，它们从排气口向外排出，重组菌也容易随之外漏。

控制办法：在通用通气型培养罐上安装排气鼓泡器（见图7-13），气体通过排气管到鼓泡瓶，再通过膜滤器，瓶中可加入杀菌剂（如2mol／L Na OH），或用电热器将排气加热至200℃ ，杀灭工程菌。

图7-13 工程菌的排气控制示意图

（2）机械密封。如搅拌轴与罐身连接处的密封不好，易使菌液外漏。一般10L以下的培养装置可用磁力搅拌，大的搅拌罐可用双机械密封来解决。

（3）取样控制。发酵过程中常要进行取样化验，为了不使工程菌外漏，最好用自动采样系统采样。若用手动采样，应注意采样管道的灭菌等工作。

（4）培养后灭菌。培养后，对培养液及发酵罐、管道进行灭菌，排出的废水及废液也应灭菌。

（5）接种控制。直接向发酵罐内倒入菌种进行接种的方法是不安全的。简单的方法是将种子瓶与培养罐用管道连接后，用无菌空气加压压入的方法来接种。另一种方法是先把种子液在安全柜内移至供接种用的小罐内，再将其与培养罐连接，将连接部分用蒸汽灭菌，把种子罐中的种子接入培养罐内。

（6）排液控制。在将培养液送至下一道工序时，应将排液口与下段工序相连接，残剩的菌液应进行灭菌处理。重组菌的培养罐中，凡有可能外漏重组菌的部分，都应与排污管道相连。

4.基因工程产品的提取与精制

基因工程产品与传统发酵产品在提取和精制上的不同，主要表现在以下两方面：

（1）传统发酵产品多为小分子，研究较多，因此放大比较有根据；基因工程产品多为大分子，缺乏必要数据，需要积累更多的放大经验。

（2）基因工程产品大多处于细胞内，提取前需将细胞破碎，增加了许多困难，且发酵液中产物浓度低，杂质多，一般大分子又不稳定，因此常用色谱分离法。