地椒种群遗传多样性的分析

遗传多样性是生物多样性的重要内容之一，是指种内个体之间或一个群体内不同个体之间的遗传变异总和，即种内的遗传多态性程度（马克平等，1995；王伯荪等，1997）。通常遗传多样性最直接的表达形式就是遗传变异性的高低和遗传变异分布格局，即群体的遗传结构（葛颂等，1994）。对一个物种来说，其进化潜力和抵御不良环境的能力不仅取决于种内遗传变异的大小，也依赖于遗传变异的群体结构（Foster，1993）。近年来，应用ISSR 分析技术对植物进行遗传多样性研究已有较多报道（ 钱韦等，2001 ； Camacho et al.，2001；Gilbert et al.，1999； Prevost et al.，1999），这些研究从分子角度揭示了许多微观领域的遗传问题。本研究利用ISSR 分析技术对中国百里香属植物地椒种下不同野生种群进行遗传多样性和遗传结构的研究，旨在:（1）揭示地椒自然种群的遗传结构和遗传多样性水平；（2）从分子水平揭示地椒种下不同变种及种群的遗传距离大小及亲缘关系远近；（3）为有效进行地椒遗传资源的评价和遗传育种以及在生态建设中的应用提供科学的理论依据。

本研究采用ISSR 分子标记技术，对分布于中国的百里香属地椒（包括种下2个变种）的不同野生种群进行了遗传多样性水平和种群遗传结构的研究。用9个ISSR引物对11个种群的共110个样品进行扩增，共得到113个清晰的扩增位点，其中多态性位点91个，多态性位点百分率为80.53%。POPGENE分析结果表明：与其他唇形科植物相比，地椒具有丰富的遗传变异（He = 0.2936；Ho =0.4479）。 地椒不同种群的遗传多样性水平由高到低依次为：怀远>左云>昌黎>日照>新泰>忻州>东胜>呼和浩特>张家口>兴凯湖>大庆，总体表现出地椒原种>地椒亚洲变种>地椒展毛变种兴凯湖种群的趋势。Nei’s 遗传多样性分析和AMOVA 分析表明，不同种群间出现了一定程度的遗传分化（Gst = 0.6070，Фst = 73.26%），种群间较高程度的遗传分化可能是地理隔离引起的基因流障碍和环境选择压力造成的。根据Nei’s遗传距离矩阵分别构建了种群间的遗传关系树状图。由UPGMA聚类分析可知，地椒种下不同变种基本聚为一类，地理分布较近的种群有着聚为同一组的趋势，但地椒怀远种群表现出与地椒原种及地椒亚洲变种间较远的遗传距离，并从地椒组中单独分出，亲缘关系较远，地椒展毛变种兴凯湖种群则完全从地椒种中分化出来。推测地椒怀远种群和地椒展毛变种兴凯湖种群已发生了很大的遗传分化。

一、材料和方法

（一）供试材料

本试验所用材料如表1所示，包括地椒及其2个变种的11个天然种群材料，以上材料均保存于江苏省中国科学院植物研究所标本馆中。每个样点野外采集10个单株，单株间采样距离超过10m，共计110个个体用于本试验多样性分析。在野外采摘的幼嫩茎端叶片均放入变色硅胶后密封带回，充分干燥后存放于-80 ℃冰箱中待用。

表1　试验材料基本情况

（二）ISSR引物的筛选及PCR扩增数据分析

ISSR的90个引物参考美国哥伦比亚大学UBC公司公布的ISSR引物序列合成。从每一种群随机抽取2个DNA样品作为模板进行PCR扩增。ISSR-PCR反应体系见优化体系建立部分所述。对ISSR-PCR的扩增产物进行1.2%的琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像系统拍照，Gel Doc图像分析仪观察。经两轮筛选后得到9个扩增条带清晰、重复性好、多态性高的引物，用于全部DNA样品的扩增。

（三）数据结果分析

ISSR为显性分子标记，故将数据作为单倍型数据进行统计，在某一位点上依据条带的有或无分别记为1或0，输入Excel表中形成二元数据矩阵。在此数据基础上进行如下统计分析：多样性分析，运用POPGENE Version 1.31软件计算地椒各种群间及种群内全部个体多态位点百分率、种群总基因多样性（Ht）、种群内基因多样性（Hs）、种群间的遗传分化指数（Gst）（Gst= 1 - Hs/Ht）、Nei’s 基因多样性指数（H）、Nei’s 遗传距离和遗传一致度及Shannon多样性信息指数（I），并对种群间及种群内个体进行聚类分析。采用Arlequin Version 3.01软件包进行AMOVA分析，统计种群内和种群间的方差、方差分量及贡献率，依此量化评价基因多样性在种群间和种群内的差异和贡献，并做差异显著性检验。

二、结果与分析

（一）地椒野生种群的遗传多样性

9条ISSR引物对11个野生地椒种群的110个个体的扩增结果见表2，不同引物扩增位点从8到12不等，平均扩增位点数为8.2，共扩增出113个清晰、易于统计的位点，多态性位点91个，平均多态位点百分率达80.5%，ISSR扩增条带范围为300～1500 bp，部分种群扩增结果见图1。在种群遗传多样性的评价参数中，多态位点百分率的计算直观简单，在一定程度上可以反映种群的遗传多样性程度，但其只是衡量种群遗传多态性的一个粗略估计值，而通过基于条带表型频率的Shannon信息多样性指数和基于Hardy-Weinberg假设的Nei’s基因多样性指数则可以得到更为可信的衡量指标。本试验中，POPGENE软件分析的数据结果表明（表3）：在物种水平上的Nei’s基因多样性指数为0.2936，Shannon信息多样性指数为0.4476；种群间的Nei’s基因多样性指数平均为0.1779，Shannon信息多样性指数平均为0.2629。各种群的遗传变异及多样性水平由高到低依次为怀远>左云>昌黎>日照>新泰>忻州>东胜>呼和浩特>张家口>兴凯湖>大庆，总体表现出地椒原种>地椒亚洲变种>地椒展毛变种兴凯湖种群的趋势。

表2　引物序列及条带统计

表3　地椒及地椒变种不同种群遗传变异参数统计

（续表）

注：H表示 Nei's基因多样性指数； I表示Shannon信息多样性指数；PPL表示种群多态位点百分率

图1　全部ISSR引物对怀远种群的扩增结果

（二）地椒野生种群的遗传结构分析

根据总的基因多样性和种群内基因多样性计算不同种群间的分化水平。所分析的11个地椒种群间遗传分化指数为0.6070，即表明总的遗传变异中有60.70%的变异存在于种群间，种群内的遗传变异为39.29%。AMOVA的分析结果与Nei’s遗传多样性分析所得到的遗传分化系数基本一致，在总的遗传变异中有73.26%的变异发生在种群间，有26.74%的变异发生在种群内，种群间和种群内变异均极显著（P < 0.001）（表4）。

表4　地椒及地椒变种不同种群内和种群间分子变异的AMOVA分析

（三）地椒种内不同种群间的遗传关系

种群间的遗传距离是衡量物种遗传变异水平的重要指标，反映种群间的遗传分化程度。根据Nei的方法计算遗传距离（表5）可知，11个地椒种群的遗传距离在0.0557～0.4627之间，说明种群间存在一定的遗传变异。其中地椒原种昌黎种群和新泰种群的遗传距离最小（0.0557），地椒原种忻州种群和地椒展毛变种兴凯湖种群的遗传距离最大（0.4627）。对11个地椒种群间的UPGMA聚类结果见图2。

表5　地椒及地椒变种不同种群间Nei's遗传一致图（右上角）和遗传距离图（左下角）

图2　地椒及地椒变种种群间Nei's遗传距离的UPGAM聚类图

三、小结与讨论

（一）地椒遗传多样性水平

本研究表明 11个地椒野生种群在物种水平的多态位点百分率为86.49%，Nei’s 基因多样性指数为0.2936，Shannon信息多样性指数为0.4476，说明地椒具有丰富的遗传变异，这与Qu（1993）对法国百里香种群的研究结果一致。地椒是一种多年生小灌木，分布范围广泛，对环境的依赖程度较小，有着很强的生命力和竞争力，同时还具有较强的克隆繁殖能力，但仍然保持着较高比例的种子繁殖，因此地椒具有较高的遗传多样性水平。

（二）地椒种群间的遗传变异与分化

POPGENE分析结果表明，Nei’s基因多样性指数计算的种群间的变异占总变异的70.7%，AMOVA分子方差分析结果表明，种群内方差分量的贡献率占26.74%，种群间方差分量的贡献率占73.26%，也就是说地椒的遗传变异主要来自不同种群间较高的遗传分化。这可能与种群间的地理隔离有关，即地理隔离对种群分化产生了影响，地理隔离使地椒种群间的基因流较低（Nm =0.2375），从而造成了种群间较高的遗传分化。植物种群内和种群间的基因流是借助于花粉、种子、孢子、植株个体以及其他携有种群遗传物质的物体为媒介进行的，其中花粉和种子扩散是自然植物种群最主要的基因流。虽然地椒可以由昆虫、风力、人为活动等帮助传粉，种子也可通过各种携带途径被带往他处，但还没有确切数据表明地椒有远距离传播者。Wright（1931）认为，如果Nm < 1，则遗传漂变可以导致种群间明显的遗传分化。从地椒野外分布特点可以看出，虽然地椒分布范围广泛，但多为片段化的不连续分布，导致随机遗传漂变，从而造成了不同种群间的隔离和较大分异。