染色体制备

目前一般推荐骨髓细胞短期培养法。相对于直接法，应用24h短期培养法能获得更多的分裂象细胞进行核型分析，这是因为短期培养可促进白血病细胞的生长和有丝分裂，而正常细胞的增殖率反而降低，故异常核型检出机会较多。此外，采用直接法制备的标本不但分裂象数量较少，而且染色体的质量也较低劣，会直接影响后期的显带处理。短期培养法不但可提高分裂象的数量，而且也可使染色体数量和质量得到某种程度的改善。但为了确保染色体检测的成功并提高核型异常的检出率，有条件的实验室应尽量同时采用直接法和培养法制备骨髓细胞染色体。如果是CLL、MM等慢性淋巴系统增殖性肿瘤，可将培养时间延长至72h，因为短期24 h培养所获得的有丝分裂象多来源于正常的髓系细胞，延长培养时间有利于异常克隆的检出。

骨髓培养接种量需根据有核细胞计数高低来确定，接种细胞数应控制在（1～3)×106/ml培养液。如接种量过大，会影响细胞生长，减少有丝分裂象的收获。如标本有核细胞数过少，延长培养时间至48 h可增加分裂象的收获。

培养液主要由RPMI1640和胎牛血清混合而成。另外，培养液中还需加入平衡盐溶液维持培养液的渗透压和酸碱度、双抗（链霉素和青霉素）抑制细菌生长等。

染色体的制备包括以下过程。

1．纺锤体的抑制　秋水仙碱（colcemid）是一种生物碱，能够抑制有丝分裂，阻止纺锤体形成，并且可使染色体单体收缩。但这一作用不影响染色体的复制和着丝粒的分裂，因此，它可使细胞停留在分裂中期，从而获得大量的中期分裂象以供核型分析之用。秋水仙碱浓度增加或处理时间延长，可增加有丝分裂指数，分散程度好，但染色体会变短；浓度降低或作用时间缩短，则分裂指数降低，染色体拉长，分散程度变差。

2．低渗　细胞经过秋水仙碱处理后，需要进行低渗处理，使染色体彼此散开，尽量减少交叉。低渗液的渗透作用不仅可使黏附于染色体的核仁物质散开，清楚显示每一个扭曲的染色体，同时还使细胞膨胀、细胞膜变薄，染色体容易铺开。低渗溶液是指渗透压和离子强度均低的溶液，一般用氯化钾溶液（0.075 mol/L），处理时间为30～40 min，处理温度为37℃。低渗可使染色体的轮廓清楚，可使染色性增强、染色时间缩短。但需要根据不同标本类型来调整低渗时间。低渗时间过短，染色体分散不好；低渗时间过长，胞膜脆弱易破裂，导致染色体人为丢失，另外染色体肿胀可导致带纹不清。

3．固定　在杀死细胞的同时，避免所研究的成分受到破坏。固定还可抽提与染色体结合的组蛋白，显带后能产生清晰的带型，提高了染色体结构的可见性。在经过氯化钾溶液低渗处理后需要尽快加入少量新鲜配制的固定液进行预固定。预固定的作用在于开始细胞固化过程，使低渗后的细胞能耐受离心过程中的机械损伤，同时裂解红细胞。目前常用的固定液是由乙酸和甲醇按1∶3比例混合而成，固定时间为15～30 min。第一次加入固定液的速度一定要慢，以免造成细胞损伤。一般在室温下操作，有报道4℃预冷的固定液可改善染色体的形态。需重复多次固定，如悬液仍存在较多红细胞，应增加固定次数，直至细胞悬液澄清。固定液中乙酸浓度增加，滴片时可增加染色体分散程度；反之，甲醇浓度增加，会降低染色体的分散程度。

4．滴片　在滴片过程中，环境条件是影响染色体制备质量的主要因素。相对湿度的增加、温度的降低可以增加染色体的分散程度，其中相对湿度是影响染色体分散程度的主要因素，但当相对湿度升高和（或）温度降低到一定程度时，染色体的分散程度反而会降低。最常使用的方法为气干法，取浸泡于冰水中的洁净玻片，吸去多余水分，仅留一薄层均匀附着于玻片表面，用吸管吸取悬液从距玻片10～20 cm处滴2、3滴于玻片上，轻轻吹匀后，乙醇灯上过火3次使其干燥。另外可使用滴片仪法进行滴片。通过使用滴片仪可以在封闭环境中将温度、湿度和气流速度等染色体制备的重要影响因素调节到最佳状态，确保染色体分散的重复性和一致性。但使用滴片仪时需根据不同实验室的实际环境条件确定合适的参数，才能够制备出高质量的染色体标本，提高染色体核型分析的准确性。

5．显带　G显带是目前国际主流的染色体显带方法，一般多选用胰酶G显带。染色体标本经胰酶处理后，再用Giemsa染液染色使染色体沿着纵轴呈现明暗相间的条带分布。G显带带型清晰，有助于染色体异常的识别，但影响显带的因素较多，较难稳定控制条件；对分裂象质量和数量的要求较高，急性淋巴细胞白血病（ALL）等部分标本染色体容易发毛；另外多数染色体末端G显带为浅色，影响了对该区域异常的识别。R带带型与G带正好相反，染色体末端为深带，可作为G带的补充，有助于染色体末端异常的识别，但R带带型不够清晰，对inv（16）等精细异常的分析会受到影响。在染槽0.25%胰蛋白酶5 ml和pH6.8缓冲液45 ml混匀，保持溶液约37℃，将玻片浸于染槽中10～40 s，分别经生理盐水和蒸馏水洗涤后置于10% Giemsa溶液中染色2～4 min，冲洗干净。每份标本均应先染1张玻片，显微镜下观察以确定胰酶处理及染片时间是否足够。新鲜玻片一般需要较短的胰酶处理时间，较老的玻片通常要求更长的胰酶处理时间。Giemsa染液配制后不稳定，易于失效，因此每次使用30～60 min或以后均需重新配制。