研究生态环境中微生物的群落组成

一、研究生态环境中微生物的群落组成、结构及其多样性

群落组成、结构及其多样性是密切联系在一起的，特定的群落会有相应的组成、结构，而任何的组成在环境微生物中都是多样的，三者的差异只是角度不同。

1.特定群落的组成、结构及其变化

从基因水平上看微生物的群落组成及结构实际上是群落的基因组组成及结构。从理论上说是能把样品中所有的基因组都给予测序，目标是认识样品中的全部基因组序列，从而了解微生物的群落组成与结构。所采用的一般方法是从环境样品中直接提取总DNA，再用微生物(或细菌)的通用引物进行PCR扩增，扩增产物通过DGGE带谱。然后用种或类群的专一性探针与得到的条带进行杂交或将条带切下，重新扩增后测序，从而得到群落的结构与组成的信息。PCR-RFLP、PAPD RT-PCR、克隆文库等方法也被经常用于对混合环境样品中微生物群落结构的分析。这些方法的敏感性更高，可以在群落水平上提供可信的基因型的信息。

DGGE技术得到广泛的应用，DGGE技术的一个显著特性就是可以同时对多份样品进行分析，因此适合于检测微生物在时间或空间上的动态变化。研究过程一般是先提取环境样品的总DNA，再经PCR扩增，扩增引物可以是通用引物或特异引物，最后对扩增产物做DGGE和染色，对指纹图谱做生物信息学分析，对比分析不同环境条件或胁迫前后的指纹图谱，我们可以了解图谱所代表群落的变化。被研究的群落的变化包括环境污染、季节变化、环境理化条件、生物条件等所带来的变化。段学军等研究了镉胁迫下稻田土壤微生物的变化，发现生物基因条带有较明显的差别，与对照土壤相比，低浓度镉胁迫时，各条带变化不大，数量稍有增加，但仍有3个条带亮度变暗或消失，表明稻田土壤绝大多数微生物对低浓度镉有一定的耐受性，基本不受影响，甚至对某些微生物类群具有一定的刺激性作用，有新增条带出现，而个别种群对镉胁迫较为敏感，种群数量大大降低。随着土壤镉浓度的增加，对土壤中微生物基因多样性的影响也逐渐增强，到土壤浓度为5mg/kg时，整个泳道条带出现明显差别，至50mg/kg时，已有大量条带消失，表明镉对稻田土壤微生物种群有明显的毒害作用，随着处理时间的延长，到第四周时，这种影响有减少的趋势。

2.研究群落多样性

生物多样性被定义为生命有机体及其赖以生存的生态综合体的多样化(variety)和变异性(variability)。生物多样性可以从3个层次上描述，即遗传多样性、物种多样性、生态系统与景观多样性。遗传多样性是指所有生物个体中所包含的各种遗传物质和遗传信息，既包括了同一种的不同种群的基因变异，也包括了同一群内的基因差异。物种多样性是指多种多样的生物类型及种类，强调物种的变异性，物种多样性代表着物种演化的空间范围和对特定环境的生态适应性，是进化机制的最主要产物。环境微生物学中的群落多样性没有严格定义，一般理解为特定群落中多样的微生物类群或多样的种群，包括遗传多样性和物种多样性，其内容更接近于群落的物种多样性，或者说是建立在物种多样性基础上的遗传多样性，当然群落多样性也可以直接从群落遗传多样性水平上理解。

能说明特定群落物种多样的研究方法都可以用于研究群落多样性，终极指标是DNA(或RNA)指纹的多样性。

研究方法多种多样，目前采用的主要方法有:

①从环境样品中提取微生物总DNA，经过PCR扩增16S rRNA基因后，对扩增产物进行DGGE或TGGE分析，直接观察其多样性。

②提取DNA和经PCR扩增后，对扩增产物用限制性内切酶进行切割并电泳，然后用标记探针杂交，从而可以进行RFLP分析，用以分析微生物RFLP的多样性。

③提取微生物总DNA后，建立DNA文库，用16S rDNA基因探针筛选DNA文库中的rDNA克隆，进行测序和比较，用以揭示微生物序列的多样性。

④从环境样品中分离微生物菌落，对各单菌落提取微生物总DNA，以16S rRNA基因探针进行杂交，用于研究微生物种的多样性。

⑤最大可能数PCR的方法，这种PCR是用于筛选样品中稀释到几乎检测不到的极低浓度靶序列的存在，每个稀释度都需要进行多次重复。其结果可用于判定多样性。

⑥竞争性定量PCR，竞争性DNA和靶DNA竞争同一引物和酶，并一起扩增，通过计算竞争性DNA最终量和起始量的比例，即可知靶DNA起始的量，从而可以判定群落多样性。

⑦真核生物特异性引物PCR扩增18S rDNA片断，扩增产物进行DGGE，所得指纹可用于比较真核微生物的多样性。

⑧特定类群特异性引物PCR扩增16S rRNA基因和二次PCR-DGGE研究特定类群的分布及多样性。

群落多样性是不同条件下生物环境中微生物群落的固有特征，在表征时空、环境条件对微生物的影响时首先涉及的是群落多样性，多样性受到广泛的研究。在分子水平上研究的群落多样性包括:①研究一种生物载体(如地衣、菌藻聚丛)中微生物群落的多样性。②各种生物反应器中微生物群落的多样性。③生态系统中特定生态位上的微生物群落多样性(包括细菌、真菌和病毒)。