环境微生物的显微观察和计量

二、环境微生物的显微观察和计量

环境微生物可以通过分离纯化，然后在纯培养条件下染色和显微观察。这里所说的环境微生物的显微观察侧重于原位观察。

1.原位土壤显微观察

原位(in situ)或在其环境中直接检测微生物，是环境微生物学家一直追求的目标。其中的埋片技术(buried slide technique)就是其中的一种。埋片技术是将玻璃显微镜载玻片包埋在土壤或沉积物样品中。经过一段时间培养后，十分小心地移出载玻片，附着有微生物的土壤微粒可直接在光学显微镜下观察。埋片技术的新发展是以毛细管代替玻片的pedoscope技术。以毛细管模拟土壤孔隙空间更接近土壤微生物生长的土壤聚合体状况。

2.应用分子探针和落射荧光显微术(epifluoresence microscopy)的原位检测

分子探针被广泛应用于环境微生物的检测。这种方法的基础是荧光标记的生物分子可被结合到一个特定的目标靶上。使用的生物分子包括蛋白质、核酸、多糖和脂类。标记的生物分子被用来选择性地结合到特定的抗原(如细菌)、糖类或核酸序列上，这样就为检测生物目标提供了工具。

用于检测目标靶的荧光标记的生物分子可分为初级或次级。初级检测试剂(primary detection reagent)是直接和特定的目标靶结合的分子(图15-1(a))测试剂(如抗体)必须先同荧光染料结合，以便试剂易于检测。次级检测试剂(secondary detection reagent)是一种能间接地与待检测分子相连的分子(图15-1(b))，标记的次级检测试剂和含有特定结合位点或半抗原(hapten)的靶特异性分子结合。靶特异性分子(target-specific molecule)也特异性地和目标靶结合，从而将有荧光标记的次级检测试剂和靶结合。现在已有多种用于标记试剂的技术，但在环境微生物学中荧光标记是最重要的。荧光原位杂交是这方面的重要应用例子。

荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridization，FISH)是在形态完整的细胞内，将荧光标记核酸探针应用到目标靶核糖体核酸(rRNA)。荧光染料标记探针已和rRNA杂交的单个细菌细胞可用荧光显微技术从混合种群中鉴别出来。探针杂交是通过rRNA的选择性的靶区域实现的，此区域由进化上保守的和进化上可变的核苷酸区域组成。因此通过选择合适的rRNA探针序列，FISH就可用来检测所有的细菌细胞(一种通用探针)或细胞的单个种群(菌株特异性探针)。

3.细菌的直接计数

生态环境中的微生物数量始终是环境微生物研究的一个重要问题。直接计数(direct count)是计量其数量的一种方法。

图15-1　荧光显微术中所使用的试剂的例子

这些可能是非特异性的，如荧光染料上的卟啶橙，其同核酸结合，或是特异性的，如荧光标记的抗体。(a)荧光标记抗体的结合(初级试剂);(b)荧光标记的抗体(次级试剂)和初级抗体的结合。

直接计数实际上是把样品(如水样)或经过处理的样品置于显微镜下直接观察(如土样)。土壤微生物的直接显微技术最重要的是要从土壤颗粒中分离微生物。对土样来说首先用分散剂如聚山梨醇酯80处理土样，打碎并通过离心把微生物从颗粒中洗脱下来，得到的已知体积的土壤悬液置于显微镜下检查。

许多染料可提高直接显微计数的效果。细菌的直接显微技术中使用最广泛的染料是吖啶橙(acridine orange，AO)，因此利用这种染料时也称为吖啶橙直接计数(acridine orange dirent count，AODC)。染色时吖啶橙插入到核酸中，经过AO染色的细菌呈现出绿色(大量RNA)或橙色(大量DNA)。直接计数中使用的另外两种重要染料是4，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)和异硫氰酸荧光素(FITC)。土壤胶体对这种计数方法会产生影响，黏土胶体能自动发出荧光或非特异性地和荧光染料结合。胶体也会掩盖土壤微生物的存在。在稀释度高时，黏胶干扰会减少;然而，微生物的数量同样会稀释，这可能会导致统计上无效的低统计数。在稀释度低时，微生物数量高些，但胶体干扰也高。在一些情况下，水样中的胶体干扰可经核孔滤膜过滤而减至最小。

利用落射荧光显微术的直接计数通常会导致数量比培养计数大两个或更多个数量级，这种差异归因于活的但未能培养的生物(viable but nonculturable organism)。生态环境中的大部分微生物处于极端不利环境下，而营养要求不能满足时会成为存活但不可培养的状态。活的但未能培养微生物的数量可以通过吖啶橙的总直接计数和直接存活力计数(direct viability count，DVC)的检测进行估算。在DVC中，通过用萘啶酸(nalidixic acid)培养来确定存活或活跃生长的细胞数量。萘啶酸抑制DNA合成，导致不能分裂的生长性细胞的伸长。因此，在荧光染色和显微观察下看起来伸长的细胞是可存活可培养的。AODC和DVC之间的差数是活的但不可培养细菌的粗略估计值。在AODC计数中可能有一些死亡的细胞，但死亡细胞降解迅速因而数量很少。活的但未能培养的微生物在环境微生物中十分重要，这因为存活但不可培养的病原体可能仍有感染并导致疾病的能力，此外环境微生物学家只研究培养的分离菌，而忽视了许多重要的不可培养的环境物种。

4.使用显微计数估算生物量

微生物生物量也是环境微生物学中研究中的重要参数。以碳表示的生物量可以通过直接计数和数量转换得到。计量的方法如表15-2。

表15-2　　计算生物量的方程

引自Paul and Clark，1989。

5.电子显微术

显微技术经历了很长的发展历史。功能不断增加的显微镜使我们能看到DNA、分子结构，甚至原子水平的结构。电子显微术在环境微生物研究中发挥着重要作用。

(1)扫描电子显微镜

扫描电子显微镜(scanning electron microscopy，SEM)与光学显微镜和透射电镜不同，它的工作原理类似于电视或电传真照片。电子枪发出的电子束被磁透镜汇聚成极细的电子“探针”，在样品表面进行“扫描”，电子束扫到的地方就可激发样品表面放出二次电子(同时也有一些其他信号)。电子信号转变成光信号，这里光信号又变成电压信号控制荧光屏上的电子束强度，从而就得到一幅放大的样品主体图像。扫描电子显微镜在环境微生物研究中被广泛使用，最常用于观察样品的表面，如生物膜的结构。

(2)透射电子显微镜

和扫描电子显微镜不同，透射电子显微镜(transmission election microscopy，TEM)是靠电子穿透样品形成影像。这种电子显微镜有利于观察生物组织的内部结构，也被广泛用于环境微生物的研究中。