植物的制备方法

15．3．3　植物SOD的制备方法

15．3．3．1　紫草籽SOD（Cu，Zn－SOD）

紫草是一种常用中草药。紫草籽富含不饱和脂肪酸、氨基酸、微量元素和SOD等，有综合利用开发价值。华东理工大学SOD课题组利用大连提供的紫草籽，经超临界萃取，从其干粉中提取得到了高纯度SOD。

（1）工艺流程：

（2）操作步骤。

①超临界流体萃取。紫草籽经粉碎机研磨后，进行超临界二氧化碳流体萃取，除去种籽所含的油脂。条件如下：提取压力为30MPa；分离压力为5．8MPa；提取温度为37．43℃；流动萃取速度为100kg/h；提取时间为2h。

②紫草籽SOD粗酶提取。取500g经超临界流体萃取后的干粉，经40目筛进行筛选后以1∶1的比例加入pH为7．8、200mmol/L的磷酸缓冲液500mL（内含1mmol/L EDTA），搅拌提取8h，抽提液经纱布过滤后离心，转速6　000r/min，离心20min，上清液即为粗酶液。

③硫酸铵沉淀。粗酶液先加入40%饱和度的硫酸铵，冰浴，搅匀溶解，1h后离心（6　000r/min，20min）取沉淀。将沉淀溶解于pH为7．8、20mmol/L的磷酸缓冲液中，其中含3mmol/L EDTA和10mmol/L的巯基乙醇。透析，浓缩，即得提取液。

④离子交换层析。上提取液上预先用pH为7．8的磷酸缓冲液平衡DEAE－52离子交换柱，经缓冲液平衡后，用500mL（含NaCl）的磷酸缓冲液进行梯度洗脱，收集洗脱液，测活后，收集样液，并浓缩。

⑤Sephadex G－100凝胶层析。将上浓缩液上用20mmol/L的磷酸缓冲液平衡过的Sephadex G－100凝胶柱，平衡后洗脱，收集活性高的洗脱液，合并浓缩液。

⑥将上浓缩液冷冻干燥得SOD冻干粉，酶比活1　855u/mg蛋白，总活性回收约22．6%，经SDS－PAGE测定，经纯化后的紫草籽SOD达电泳纯。

15．3．3．2　从绿豆中提取SOD

（1）提取。称取2kg绿豆，浸于水中约20h使绿豆胀大一倍左右。经绞肉机磨碎后，置入4．3L的0．1mol/L磷酸氢二钠溶液中。在pH为7．3的条件下用打碎机将碎绿豆打成匀浆，间歇搅拌约2h，然后用纱布压挤出提取液。

（2）硫酸铵分级沉淀。在提取液中加入硫酸铵，使达到35%饱和度，用以沉淀非SOD的蛋白质。离心后取出上清液，再加硫酸铵，使达到55%饱和度。离心后保留含有SOD的沉淀。

（3）丙酮沉淀。将沉淀悬浮于少量水中，透析，除去硫酸铵。离心后弃去沉淀。将上清液冷却至0℃，加入预冷至－20℃的丙酮。在0℃下离心，并将上清液加入等量丙酮，收集沉淀。

（4）柱层析。将沉淀悬浮于5倍体积的2．5mmol/L pH为7．8的磷酸钾溶液，然后离心除去不溶杂蛋白。加硫酸铵于上清液使达到65%饱和度。将沉淀以0．1mol/L NaCl－2．5mmol/L的磷酸钾缓冲液（pH为7．8）溶解、透析。如有沉淀，应离心除去。将上清液上Biogel P－60柱，收集A₂₅₉/A₂₈₀大于1的流出液。再加硫酸铵使达到65%饱和度，并按上述类似方法使沉淀溶于少量水，并与2．5mmol/L pH为7．8的磷酸钾溶液平衡，然后上DE32柱，以0～0．1mol/L NaCl的pH为7．8、2．5mmol/L的磷酸钾缓冲液进行梯度洗脱。收集蓝绿色流出液，再上一次DE32柱。用0．1mol/L NaCl的pH为7．8、2．5mmol/L的磷酸钾缓冲液洗脱。将含有SOD的洗脱后收集液混合，上Biogel P－30柱，以同样缓冲液平衡，收集高比活性的流出液。用缓冲液透析、冷冻干燥，即得纯SOD。

15．3．3．3　枸杞果实Fe－SOD的纯化

枸杞果实按1∶2（体积质量密度）加入50mmol/L的磷酸缓冲液（pH为7．8，内含1mmol/L的EDTA），在组织捣碎机中充分破碎，匀浆，用8层纱布滤去残渣，滤液经10　000r/min冷冻离心15min，上清液即为粗酶液。粗酶液加入硫酸铵至35%饱和度，4℃下静置2h后于10　000r/min冷冻离心15min。弃去沉淀，上清液再加硫酸铵至85%饱和度，4℃下静置过夜，15　000r/min冷冻离心15min，收集沉淀。将沉淀溶解于5mmol/L的磷酸缓冲液中（pH为7．8，含0．1mmol/L的EDTA，以下称A液），透析过夜。透析液经离心后加入用A液充分平衡过的DEAE－Sephadex A－50柱上，用A液洗至A₂₈₀值低于0．02，再进行梯度洗脱。对氰化钾不敏感的Fe－SOD在0～250mmol/L的NaCl（含100mmol/L的磷酸缓冲液，pH为7．8）浓度梯度从柱中洗脱下来。将活性部分合并，对A液透析，再进行第二次DEAE－Sephadex A－50柱层析。活性部分透析后冷冻干燥，用A液溶解，进行Sephadex G－100柱层析。在经过第二次同样柱层析后，得到相互重叠的单一的蛋白峰和酶活性峰。将活性部分对水透析后冷冻干燥，得到棕色的Fe－SOD。枸杞果实Fe－SOD的各步纯化结果见表15－16。

表15－16　枸杞Fe－SOD纯化表

注：1kg鲜枸杞果实纯化后得1．2mg的Fe－SOD，酶比活为983u/mg蛋白。

（摘自植物生理学报，1994，20（2）：128－136）