原料的预处理

15．2．1　SOD原料的预处理

15．2．1．1　动物血SOD原料的预处理

我国已开发的动物血SOD的品种有猪、牛、羊、牦牛、马、狗、鹿和鸡鸭等，它们都是Cu，Zn－SOD，但市售的动物血SOD主要是猪、牛血SOD。原料血应取自健康的动物血，为了防止血液凝固，在取血时应事先加一定量的抗凝剂如肝素、柠檬酸三钠。SOD在血细胞内，离心所得的血细胞要用0．9%NaCl反复清洗，以除去血细胞表面的杂质。干净的红细胞用去离子水溶血，在不断搅拌情况下溶血30min。

15．2．1．2　植物SOD的原料预处理

首先要弄清植物中富含SOD的部位，然后决定取材于根、茎、叶还是果实。接着选择合适的破碎方法。植物组织最常用的破碎方法是高速组织捣碎机和球磨机，处理量大的可选用高压匀浆泵。

预处理中最关键技术是抽提方法的选择和破碎生物材料。一般要在缓冲液或盐溶液中浸泡；浸泡液由pH缓冲剂、离子强度调节剂、抗氧剂和金属螯合剂组成，其最佳浓度由预实验确定。如果是含水量丰富的果实（如大豆、紫草籽等）最好在抽提前先采用超临界萃取方法除去油脂，以免影响其抽提效果。

SOD的活性稳定性与pH有关，在酶促反应中一般伴随着质子的利用与释放，使环境pH发生变化；而环境pH的改变又反过来影响酶促反应，因此在抽提过程中要严防pH的干扰。多数抽提是以缓冲液为基础液，缓冲盐溶液通过其缓冲对酸根与对应盐发生释放与结合质子的作用，维持溶液的pH在一定范围内不受稀释或加入其他物质的干扰，表15－10是酶抽提中常用的缓冲系统及pKa值。

表15－10　常用的缓冲系统及其pK_a值

在植物中，通常富含有机酸、维生素、微量元素、酚类和黄酮类化合物，它们在抽提时常与SOD同时释放出来。它们中有的是抗氧剂（如维生素C、黄酮类化合物），会影响SOD的活性测定。有的是有机酸，会影响抽提液的pH，导致酶活性大量丧失。有的是金属螯合剂（如微量元素），而SOD是全酶，会影响SOD的活性中心，导致酶活性下降。

15．2．1．3　微生物SOD的原料预处理

就目前而言，SOD用微生物细胞生产的不多，涉及菌种亦仅是大肠杆菌和酵母，以及从综合利用考虑的啤酒酵母。

微生物破碎分机械破碎法和化学破碎法两种，或这两种方法的结合。酵母和E．coli破碎主要采用高压匀浆（high－pressure－homogenization）和超声波破碎法（utrasonication），这两种方法有很强的破碎效果。超声波破碎法的有效能量利用率较低，操作过程产生大量的热，因此操作需在冰浴中进行，由于超声波对于冷却要求相当苛刻，所以不易放大，主要用于实验规模的细胞破碎。而工程菌发酵规模比较小，故常用此法。

破碎细胞的目的是要得到SOD或几种有用的目标产物。因此，在细胞内存在的许多物质中选择性释放目标产物（SOD），而使其他物质尽量少地释放出来，并且尽量降低细胞的破碎程度对后续分离十分重要。SOD不是膜酶，所以在细胞质中，只要选择合适的破碎方法，调节溶液的pH、离子强度和加入适量金属螯合剂，就可获得较高的提取率。

目前重组SOD有可溶性表达和包含体表达两种。可溶性表达分离较简单，只要细胞破碎后即可提取，而包含体由于除表达产物（SOD）外，还含有微量的质粒、rRNA和RNA聚合酶等分离比较困难，而且还要通过复性SOD才显示活性，故目前此法不常用。华东理工大学已成功克隆和表达了Cu，Zn－SOD，Mn－SOD和EC－SOD，它们都是可溶性表达。包含体的分离是从细胞破碎开始的，从细胞破碎分离回收包含体后，加入变性剂溶解包含体，使之成为可溶性伸展态，然后除去变性剂使表达产物再折叠（refolding），恢复天然SOD构象。目前SOD包含体的复性工艺主要有以下两条：

（1）细胞破碎（超声波）→离心提取包含体→加复性剂溶解包含体→除去变性剂复性。

（2）细胞破碎→洗滤除去可溶性产物→加变性剂溶解→除去变性剂复性。

用上述方法复性，其复性率一般在20%～40%，复性率低的主要原因是：变复性主要凭经验摸索，成功率较低；变性的蛋白质容易发生聚集，形成不可逆的变性沉淀。但是既然包含体产物的一级结构是正确的，根据一级结构决定高级结构的原则，包含体复性应该成功率是高的。有人利用反胶团萃取人工变性蛋白（RNase A）后除去变性剂复性，得到令人振奋的结果，复性率可达90%以上。

原料预处理虽然仅是纯化工艺很小的一部分，但这一步骤非常重要，它不仅保证提取工艺的高效率，而且最大限度去除目标产物（SOD）以外的杂质，简化纯化工艺，提高SOD产品质量和数量。