修饰反应专一性的控制

6．2．1　修饰反应专一性的控制

如果对于催化活性、底物结合或构象维持有关的功能基团一无所知，那就只有通过反复实验去了解。在这样的探索性研究中，修饰剂及修饰反应条件的选择至关重要，直接影响修饰反应的专一性。

6．2．1．1　试剂的选择

实验目的不同，对专一性的要求也不同。因此，选择试剂在很大程度上要依据修饰的目的。例如，对氨基的修饰可有几种情况：修饰所有氨基，而不修饰其他基团；仅修饰α－氨基；修饰暴露的或反应性高的氨基以及修饰具有催化活性的氨基等。修饰的部位和程度一般可用选择适当的试剂和反应条件来控制。如果修饰目的是希望改变蛋白质的带电状态或溶解性，则必须选择能引入最大电荷量的试剂。用顺丁烯二酸酐可将中性的巯基和酸性pH下带正电荷的氨基转变成在中性pH下带负电荷的衍生物。如果要修饰的蛋白质对有机溶剂不稳定，必须在水介质中进行反应，则试剂应选择在水中有一定的溶解性的。在选择试剂时，还必须考虑反应生成物容易进行定量测定。如果引入的基团有特殊的光吸收或者在酸水解时是稳定的，则可测定光吸收的变化或作氨基酸全分析，这是最方便的。用同位素标记的试剂虽较麻烦，但有其优越性，它可对蛋白质修饰反应进行连续测定，进行反应动力学的研究。试剂体积的大小也要注意。试剂体积过大，往往会由于空间障碍而不能与作用的基团接近，一般来说，试剂的体积以小一些为宜，这样既能保证修饰反应顺利进行，又可减少因空间障碍而破坏蛋白质分子严密结构的危险。

一般地说，选择蛋白质修饰剂要考虑如下一些问题：修饰反应要完成到什么程度；对个别氨基酸是否专一；在反应条件下，修饰反应有没有限度；修饰后蛋白质的构象是否基本保持不变；是否需要分离修饰后的衍生物；反应是否需要可逆；是否适合于建立快速、方便的分析方法等。在决定选择某一修饰方法之前，必须对上述问题进行权衡。

用于修饰酶活性部位的氨基酸残基的试剂应具备以下一些特征：选择性地与一个氨基酸反应；反应在酶蛋白不变性的条件下进行；标记的残基在肽中稳定，很容易通过降解分离出来进行鉴定；反应的程度能用简单的技术测定。当然，不是单独一种试剂就能满足所有这些条件，一种试剂可能在某一方面比其他试剂优越，而在另一方面则较差，因此，必须根据实验目的和特定的样品来决定使用什么样的试剂。

6．2．1．2　反应条件的选择

蛋白质与修饰剂作用所要求的反应条件，除允许修饰能顺利进行外，还必须满足如下要求：一是不造成蛋白质的不可逆变性——为了证明这一点，必须做对照实验；二是有利于专一性修饰蛋白质——为此，反应条件尽可能在保证蛋白质特定空间构象不变或少变的情况下进行，反应的温度、pH都要小心控制，反应介质和缓冲液组成也要有所考虑。缓冲液可改变蛋白质的构象或封闭反应部位，因而影响修饰反应。如磷酸盐是某些酶的竞争性抑制剂，因而该离子的结合可能封闭修饰部位。碳酸酐酶的酯酶活性能被氯离子抑制，因而修饰反应所用缓冲液不应含有氯离子。

6．2．1．3　反应的专一性

在蛋白质化学修饰研究中，反应的专一性非常重要。若修饰剂专一性较差，除控制反应条件外，还可利用其他途径来实现修饰的专一性。

（1）利用蛋白质分子中某些基团的特殊性。活性蛋白特殊的空间结构能影响某些基团的活性，蛋白水解酶分子中的活性丝氨酸是一个很突出的例子。二异丙基氟磷酸酯（DEP）能与胰凝乳蛋白酶的活性丝氨酸作用，结果迅速导致酶失活，但DEP在同样条件下却不能与胰凝乳蛋白酶原及一些简单的模拟化合物作用。在蛋白质分子中特别活泼的基团，如上述活性丝氨酸在适当条件下只是其本身发生作用，而其他基团皆不作用，这种现象称为“位置专一性”，因为这是由它在蛋白质分子中所处的位置环境所决定的。

（2）选择不同的反应pH。蛋白质分子中各功能基的解离常数（pK_a）是不同的，所以控制不同的反应pH，也就控制了各功能基的解离程度，从而有利于修饰的专一性。例如，用溴（碘）代乙酸（或它的酰胺）对蛋白质进行修饰时，试剂可与半胱氨酸、甲硫氨酸、组氨酸的侧链及α－氨基、ε－氨基发生作用。当反应pH为6时，只专一地与组氨酸的咪唑基作用；当反应pH为3时，则专一地与甲硫氨酸侧链作用。

（3）利用某些产物的不稳定性。在高pH下，用氢氰酸、二硫化碳、O－甲基异脲和亚氨酸等，可将氨基转变成脲和胍的衍生物。虽然巯基也能与上述试剂作用，但因pH高，与巯基形成的产物迅速被分解。

（4）亲和标记。亲和标记是实现专一性修饰的重要途径。亲和标记试剂除了能与蛋白质作用外，还要求试剂的结构和与蛋白质作用的底物或抑制剂相似。因此，在作用前，试剂先以非共价键形式结合到蛋白质的活性部位上，然后再发生化学作用，将试剂置于活性部位基团上。这种方法在研究酶的活性部位时特别有用。例如，对甲基苯磺酰氟能作用于胰凝乳蛋白酶的活性丝氨酸上。

（5）差别标记。在底物或抑制剂存在下进行化学修饰时，由于它们保护着蛋白质的活性部位基团，使这些基团不能与试剂作用。然后将过量的底物或抑制剂除去，所得到的部分修饰的蛋白质再与含同位素标记的同样试剂作用，结果只有原来被底物或抑制剂保护的基团是带放射性同位素标记的。用这一方法可直接得到蛋白质发挥功能作用的必需基团。

（6）利用蛋白质状态的差异。有时在结晶状态下进行反应，可以提高修饰的专一性。例如，核糖核酸酶在晶体状态下进行羧甲基化时，反应主要集中在第119号组氨酸上，对第12号组氨酸的修饰很少，两者之比为60∶1。但在水溶液中进行同样的修饰时，两者之比为15∶1。