鸡胚的接种与收获

实验一　鸡胚的接种与收获

一、实验目的

了解鸡胚的发育过程以及基本构造;掌握鸡胚尿囊腔接种病毒以及收获病毒的方法，获得大量的流感病毒及抗原。

二、实验原理

鸡胚是正在发育中的机体，是有生命的实验动物，许多人类病毒和动物病毒、立克次氏体等均可以在鸡胚的相关部位繁殖。鸡胚可用作病毒的分离、制备抗原和疫苗，以及中和实验。

在本实验中，将流感病毒接种于鸡胚尿囊腔后，病毒就在尿囊的内胚层细胞繁殖，将繁殖的病毒颗粒释放至尿囊液中，从而使尿囊腔中含有大量病毒，通过收获尿囊液，可以得到较大量的流感病毒。

三、实验材料及器械

(1)9～11日龄鸡胚。

(2)甲型流感病毒(H1N1)。

(3)照蛋器、孵卵架、孵育箱、1ml注射器、5号针头、三角锉刀、无菌镊子、眼科剪刀、毛细吸管。

(4)2.5%碘酒棉球、75%酒精棉球、透明胶纸(或固体石蜡)。

四、实验方法及步骤

1.尿囊腔接种

取孵育9～11日龄的鸡胚，在照蛋器上照视并用铅笔画出气室以及胚胎的位置(图1-1)，在距气室底边0.5cm处的卵壳上标明开孔记号。以碘酒、酒精消毒开孔处，然后开一小孔，再用酒精消毒。

图1-1　9～11日龄鸡胚结构示意图

注意事项:

此步应只钻破卵壳而不损坏壳膜。

注射针头由小孔刺入0.5～1cm，注射器向钝头方向倾斜约45°，注入0.1～0.2ml病毒液(图1-2)，用透明胶纸封口(或将固体石蜡融化后封口)。置33～35℃孵育48～72h。自接种日起每日检视一次。

图1-2　尿囊腔接种示意图

注意事项:

24h内死亡的多为非特异性因素所致，应及时剔除。

2.解剖及收获

流感病毒一般在接种48h后就可收获。收获前将鸡胚于4℃冰箱过夜或－20℃1h，将鸡胚冻死，使血球凝固，以免收获时红血球流出，影响收获的病毒滴度。

经冰冻的鸡胚用碘酒、酒精消毒，用无菌镊子轻轻揭去气室部位卵壳，撕去壳膜，然后用无菌毛细管通过绒毛尿囊膜进入尿囊腔吸出尿囊液。收取的尿囊液可置无菌小瓶内4℃保存，或于－20℃保存待用。

五、方法评注

1.背景材料

病毒疫苗以及病毒研究是以培养、收获足够量的病毒为基础。病毒的生长和繁殖必须在细胞内进行。目前培养病毒的方法主要有两种，一种是通过病毒的细胞培养得到病毒，另一种是采用病毒感染动物(包括鸡胚)获得病毒。鸡胚是正在发育的活体，其组织分化程度低，细胞代谢旺盛，适于许多动物以及人类病毒的生长增殖。

鸡胚用于病毒培养具有来源充足，价格低廉，操作简单，无需特殊设备，易感病毒谱较广以及对接种的病毒不产生抗体等许多优点，但也存在着明显的不足，如可能含有某些家禽病毒的母源抗体，甚至还可能带有鸡白痢沙门氏菌、支原体、鸡白血病病毒、鸡贫血病毒等病原，可以通过采用无特定病原体(Specefic pathogen Free，SPF)级别的鸡胚来避免。

2.其他几种鸡胚接种方法

(1)卵黄囊内注射法

取6～8日龄鸡胚，从气室顶侧接种(针头插入3～3.5cm)(由于胚胎及卵黄囊位置已定，也可从侧面钻孔接种，侧面接种不易伤及鸡胚，但针头拔出后部分接种液有时会外溢，需用酒精棉球擦去)，将针头插入卵黄囊接种0.1～0.2ml病毒液。其余步骤同尿囊腔内注射(图1-3)。

图1-3　卵黄囊接种法

(2)绒毛尿囊膜接种(人工气室法与直接接种法)

①人工气室法

取10～11日龄鸡胚，先在照蛋器下画出气室位置，并选择绒毛尿囊膜区作一“记号” 。将胚蛋横卧于蛋座上，绒毛尿囊膜区“记号”朝上。用碘酒消毒记号处以及气室中心部，在气室中心部钻小孔。然后用锥子轻轻锥击记号处蛋壳，约0.5mm深，使其卵壳穿孔而壳膜不破。用洗耳球吸去气室内空气，随即因上面小孔进入空气而绒毛尿囊膜陷下形成一个人工气室，天然气室消失(图1-4)。自上面小孔直刺破卵膜进入人工气室3～5mm (接种时针头与卵壳成直角)，注入0.1～0.2ml病毒于绒毛尿囊膜上。接种完毕用熔化的石蜡或者透明胶纸封闭两孔，人工气室向上，横卧于孵化箱中，逐日观察。

图1-4　鸡胚绒毛尿囊膜人工气室接种

②直接接种法

将鸡胚直立于蛋座上，气室向上，在气室区中央消毒打孔，接种时针头先刺入卵壳约0.5cm，将病毒滴在气室内的壳膜上(0.1～0.2ml)，再继续刺入1.0～1.5cm (刺破壳膜)，拔出针头使病毒液慢慢渗透到气室下面的绒毛尿囊膜上，然后用石蜡封孔，放入孵化箱培养。

本方法的原理为:壳膜被刺破后不能再闭合，而绒毛尿囊膜有弹性，当针头拔出后被刺破的小孔立即又闭合。

(3)羊膜腔内接种(开窗法与盲刺法)

①开窗法

取10～11日龄鸡胚，直立于蛋座上，气室向上，在气室处去蛋壳使之开一个小窗，从窗口用小镊子剥开蛋膜，一只手用平头镊子夹住羊膜腔并向上提，另一只手注射0.05～0.1ml病毒液至羊膜腔内，然后用石蜡或者透明胶纸封闭人工窗，将蛋放入33～35℃孵育孵化箱中直立孵化。

此法可靠，但胚胎易受伤而死，而且易污染。

②盲刺法

将鸡胚直立于蛋座上，将蛋转动使胚胎面向实验者。在气室顶部到边缘的一半处打一孔，用40mm长的针头垂直插入，约深30mm以上。如已刺入羊膜腔，能使针头拨动胚胎，即可注入病毒液0.1～0.2ml，如针头左右移动时胚胎随着移动，说明针头已刺入胚胎，这时应将针头稍稍提起后再注射。拔出针头后用石蜡或者透明胶纸封闭小孔。置孵化箱中培养。