引物酶是dna聚合酶吗

的生物合成_解读生命化学

第三节　DNA的生物合成

现代生物学已充分证明，核酸是生物遗传的物质基础。除少数RNA病毒外，几乎所有的生物均以DNA为遗传信息的载体。生物的遗传信息以密码的形式贮存在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序。在细胞分裂过程中，通过DNA复制把亲代细胞所含的遗传信息忠实地传给子代细胞。在子代细胞的生长发育过程中，这些遗传信息通过转录传递给RNA；再由RNA通过翻译转变成相应的蛋白质多肽链上的氨基酸序列，由蛋白质执行各种各样的生物学功能，使后代表现出与亲代极其相似的遗传特征。

DNA复制（replication）是指以亲代DNA分子的双链为模板，按照碱基配对的原则，合成出与亲代DNA分子相同的两个双链DNA分子的过程。而转录（transcription）则是以DNA分子中的一条链为模板，按照碱基配对原则，合成出一条与模板DNA链互补的RNA分子的过程。翻译（translation）（或称转译）是以mRNA为模板，按照三个核苷酸碱基（三联体密码子）决定一个氨基酸的原则，把mRNA上的遗传信息转换成蛋白质分子中特定的氨基酸序列的过程。

20世纪70年代，人们发现RNA病毒能以自己的RNA为模板复制出新的病毒RNA。其中，逆病毒（retrovirus）在宿主细胞中能以其RNA为模板合成DNA，称为逆转录（reverse transcnption）。

图5—9　中心法则

遗传信息的流动过程可用分子生物学的中心法则来概括，如图5—9所示。

中心法则奠定了遗传、免疫、进化系统在分子水平上的理论基础。

自从1953年Watson和Crick提出DNA双螺旋结构模型以来，对核酸的结构与功能的探索已成为生命科学中最重要、最活跃的研究领域。尤其是近20年，对核酸的生物合成及其调控机理的研究日渐深RNA复制人，不仅使人们对细胞的生长、发育、遗传、变异等重要的生命现象有了更加深刻的认识，极大地推动了相关领域的研究工作；而且以这方面的理论和技术为基础，建立并发展了基因工程。这些研究和技术的不断发展，将给人类的生产和生活带来深刻的变化。

一、DNA的复制方式

作为遗传物质的DNA不仅要贮存大量的遗传信息，而且还必须能够准确地自我复制，并有可能在不损伤亲代主要信息的前提下，发生少量的变异。DNA严格遵循碱基配对原则，形成互补的双链结构，这对于保持遗传信息的稳定性和实现复制的准确性具有十分重要的意义。

（1）半保留复制　早在1953年，Watson和CrIck在DNA双螺旋结构的基础上提出了DNA的半保留复制假说。他们推测复制时DNA的两条链分开，然后用碱基配对方式按照单链DNA的核苷酸顺序合成新链，以组成新DNA分子。这样新形成的两个DNA分子与原来DNA分子的碱基顺序完全一样。每个子代分子的一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的。这种复制方式称为半保留复制，后来的许多实验都证实了DNA的这种半保留复制（图5-10）。

5-10　双链DNA的复制模型

（2）DNA复制的分子机制　按照wats Oilcrjck假说，DNA的两条链的方向相反，所以复制时，如新生DNA的一条链从5＇→3＇端合成，则另一条链必须从3＇→5＇端延伸。可是，迄今发现的DNA聚合酶都只能催化DNA链从5＇→3＇端延长。

5-11　DNA的半不连续复制示意

1968年冈崎等用³　H脱氧胸苷掺人噬菌体感染的大肠杆菌，然后分离经过标记的DNA产物，发现短时间内首先合成的是较短的DNA片段，接着出现较大的分子。一般把这些DNA片段称为冈崎片段。进一步的研究证明，冈崎片段在细菌和真核细胞中普遍存在。细菌的冈崎片段较长，有1000～2000个核苷酸。

冈崎的重要发现以及后来许多其他人的研究成果，使人们认识到DNA的半不连续复制过程：新DNA的一条链是按5＇→3＇方向连续合成的，称为“前导链”；另一条链的合成则是不连续的，即先按5＇→3＇方向合成若干短片段（冈崎片段），再通过酶的作用将这些短片段连在一起构成第二条子链称为后随链。DNA的半不连续复制见图5-11。

二、有关DNA复制的酶

DNA的复制是一个十分复杂而精确的过程，涉及许多蛋白质因子和酶。由于DNA是由脱氧核苷酸聚合而成的，所以与DNA复制有关的酶，包括DNA聚合酶、一些解除DNA高级结构的酶和蛋白质因子。

1.DNA聚合酶——DNA复制的基本酶

DNA聚合酶（DNA polymerase）是催化体内以脱氧核苷三磷酸（dNTP）为底物合成DNA的一类酶，不同生物体内DNA聚合酶的种类不同。

（1）原核细胞DNA聚合酶

①pol.·Ⅰ　1956年A.Kornberg等在大肠杆菌中发现了第一个DNA聚合酶（pol·Ⅰ），该酶是一个Mr＝109000的单链蛋白，它所催化的DNA合成反应是以DNA作为模板（termplate）的，故又被称为依赖DNA的DNA聚合酶。实验证明，pol·Ⅰ催化DNA合成反应所需要的条件有：单链DNA作为模板，四种脱氧核苷三磷酸作为底物，与模板DNA链互补的一段具有3＇-OH末端的低聚脱氧核苷酸为引物，另外需要M2＋或Mn2＋。聚合反应按5＇→3＇的方向进行，产物是与模板DNA互补的DNA链。

pol·Ⅰ是一种多功能酶，除了具有5＇→3＇聚合催化功能外，还具有外切核酸酶的活性，即同时具有3＇→5＇外切酶活性和5＇→3＇聚合酶活性。pol·Ⅰ的3＇→5＇外切酶活性与5＇→3＇的聚合酶活性作用正好相反，当存在与模板错配的核苷酸时，这种活性就起作用，切除错配的核苷酸，然后再继续进行聚合反应，从而起到了校正功能（正确配对的底物能抑制3＇→5＇的外切酶活性）。pol·Ⅰ的5＇→3＇外切酶活性主要用于切除引物、变异核苷酸，故又起到了修复功能。poI·Ⅰ的各种酶活性都是以聚合酶活性为中心的。

②pol·Ⅱ、pol·Ⅲ　20世纪70年代初，从大肠杆菌中先后又分离出两种DNA聚合酶，分别命名为DNA聚合酶Ⅱ和聚合酶Ⅲ。

pol·Ⅱ和pol·Ⅲ都具有5＇→3＇的DNA聚合酶活性，催化反应所需要的条件也与pol·I基本相同，只是所需引物为RNA。在外切酶活性方面，pol·Ⅱ只有3＇→5＇的外切酶活性，而无5＇→3＇的外切酶活性。pol·Ⅲ具有两个方面的外切酶活性，是复制时发挥主要作用的酶。

（2）真核细胞DNA聚合酶　真核生物中至少拥有五种DNA聚合酶，分别命名为α、β、γ、δ和ε。它们能在5＇→3＇方向上聚合DNA链，但各酶的具体功能不尽相同。

真核细胞中与DNA复制相关的主要聚合酶是DNA pol·α和DNA pol·δ，它们在DNA复制中可能是互相协作的，poI·α催化前导链合成，pol·α催化后续链的合成。pol·δ还具有3＇→5＇外切酶的校正功能，并具有解旋酶的作用。

DNA pol·γ是首先在真核细胞的线粒体中发现的，它催化相关DNA的复制。pol·ε在真核细胞内主要与修复有关。pol·β可能与pol·α和poI·ε在DNA修复中共同发挥作用。

2.DNA连接酶——连接DNA片段的酶

DNA连接酶催化一个DNA链的5＇-磷酸根与另一个DNA链的3＇-羟基形成磷酸二酯键，但是这两个链必须与同一个互补链结合，而且两个链必须是相邻的，反应要供给能量。

3.引物酶和引发体

各种DNA复制开始时都需要有引物，在引物基础上才能进行DNA的聚合反应。因为所有的DNA聚合酶都只有按照模板链的指令在引物3＇-OH端延伸新链的功能，没有从头开始合成的活力。通常，引物是在复制前先行合成的一小段RNA，它的合成是RNA聚合酶与复制起点结合后，以DNA为模板而催化合成的引物，酶的相对分子质量为60000，它必须与另外几种辅助蛋白质组装成引发体，才有合成引物的活性。

4.解链酶

解链酶又称解旋酶。DNA在复制和修复时都必须解开双链，使其成为单链，提供单链DNA模板，DNA解旋酶就是催化DNA双螺旋解链的酶。解旋酶是借助ATP的能量来解开DNA双链的。原核细胞中，解旋酶与单链DNA的亲和力强，并能沿模板DNA 5＇→3＇方向由单链向双链部分移动。各种解旋酶与引物酶等常构成复合体，在DNA复制时有协同作用，从而解开双螺旋。

5.旋转酶

旋转酶即拓扑异构酶，其作用是消除DNA的超螺旋，旋转酶根据作用于DNA的方式不同而分为两类：旋转酶Ⅰ和旋转酶Ⅱ。

6.单链结合蛋白

单链结合蛋白（SSB）又称为螺旋去稳定蛋白，是一种能与单链DNA结合的特异蛋白。当它与经解链的单股DNA链结合后，两条DNA链就不能再形成双螺旋，保证了单链区的稳定，让单链能够作为DNA合成的模板。

单链DNA与SSB结合后，既可保护自身免遭核酸酶的降解，又可防止解链的DNA再度自发生成螺旋，使单链DNA保持伸展状态，并使碱基暴露，以便作为合成新链的模板。

各种生物细胞中DNA的复制过程大同小异，大致包括以下几个阶段：

图5-12　DNA复制过程示意

（1）起始　起始阶段包括对起始位点的识别，DNA双螺旋的解开，引物的合成几个步骤。

①识别起始位点　DNA的合成并不在模板的任意部位开始，而是从特定的位点开始。原核细胞染色体的复制只能从一个特定位点开始，在另一特定位点终止，能独立进行复制的单位称为复制子。真核细胞基因的线状DNA上有多个复制起点，是多复制子的。引物酶等一些特殊蛋白质可识别并结合模板的起始位点，开始引物的合成。

②DNA解链　旋转酶、解链酶与DNA的复制起点结合，解开双螺旋形成两条局部的单链，并且单链结合蛋白也随即结合到DNA单链上。

③RNA引物的生成　引物酶（RNA聚合酶）以DNA链为模板合成RNA引物。原核细胞中引物一般长为50～100个核苷酸；真核细胞的引物较短，哺乳动物的引物约10个核苷酸。前导链的模板上只合成一段引物，而后续链的模板上可以合成许多个冈崎片段的引物（图5-12）。

（2）延伸　在DNA　pol·Ⅲ（真核为α酶）的催化下，根据模板链3＇→5＇的核苷酸顺序，在RNA引物的3＇-OH末端逐个添加脱氧核苷三磷酸，每形成一个磷酸二酯键，即释放一个焦磷酸，直至合成整个前导链或冈崎片段。这二者的新链合成延伸方向都是5＇→3＇。在延伸（elongation）阶段，还有延伸因子、ATP及其他一些蛋白质参与。新链（段）的延伸速度很快，在大肠杆菌可达每分钟50000bp。延伸的方向在许多情况下是定点、双向、对称并等速的，少数情况下有单向，或双向非对称进行的。

（3）终止　终止（termination）阶段主要发生两种生化事件，即：

①RNA引物的切除和缺口的填补　每个岗崎片段5＇端的引物由特异核酸酶RNaseH或pol·Ⅰ的5＇一3＇外切酶活性切除引物，然后由pol·Ⅰ的5＇→3＇的聚合活性填补缺口。

②DNA片段的连接　对后续链而言，由pol·Ⅰ填补缺口，最后需要由DNA连接酶催化形成磷酸二酯键，完成新链的合成。

新DNA分子还需在旋转酶的作用下形成具有空间结构的新DNA，实际上是一边复制，一边就螺旋空间化了。

三、DNA的损伤与修复

一些物理、化学因子，如紫外线、电离辐射和化学诱变剂能使细胞DNA受到损伤，实质就是DNA碱基发生突变导致DNA结构和功能发生改变，而引起生物的突变或致死。细胞具有一系列修复机制，能在一定条件下使DNA的损伤得到修复。目前知道的修复系统有两大类：光诱导修复和不依赖于光的暗修复。

（1）光修复　紫外光照射可以使DNA链中相邻的嘧啶形成一个环形丁烷，主要产生胸腺嘧啶二聚体，二聚体的形成可以使DNA的复制和转录功能受到阻碍。

受紫外光损伤的细胞，在强的可见光照射后，大部分能恢复正常。这是由于可见光激活了细胞内的光裂合酶，使嘧啶二聚体解开，恢复成两个单独的嘧啶碱基。光修复酶分布很广，从单细胞生物到鸟类都有，但在高等哺乳动物中不存在。

图5—13　DNA损伤的切除修复

（2）暗修复　暗修复也称切除修复，是比较普遍的一种修复机制，对多种损伤均能起到修复作用。切除修复包括两个步骤：第一步，由特异的修复酶识别损伤部位，并切除包括损伤部位在内的单链DNA片段；第二步，由DNA聚合酶和连接酶以另一条完整的链为模板进行修补（图5—13）。

四、DNA畸变与遗传病

在遗传信息的传递过程中，DNA是遗传信息的原始载体，蛋白质是遗传信息的最终体现。基因是DNA分子中特定区段，它的改变导致蛋白质结构和功能发生改变，表现出相关病理现象，这种疾病称为分子病或遗传病，所以说遗传病的本质是基因突变。

基因突变是因DNA碱基序列改变所造成的基因结构异常，可分为单点突变和多点突变。多点突变一般是指较大的DNA片段插入或缺失；单点突变是DNA序列上单个碱基的改变，包括碱基替换和移码突变。

五、DNA重组与DNA克隆

1.DNA重组

DNA重组是指在体外按既定的目的和方案，将目的基因片段与载体结合，构成DNA重组体，再将重组分子导人受体细胞，使其与受体细胞基因组合，在细胞中繁殖和扩增，也可进行基因表达，产生特定的基因产物或新性状遗传物质的过程。DNA重组技术是基因工程的主要内容。

2.DNA克隆

所谓克隆是指通过无性繁殖过程产生与亲代完全相同的子代群体，原来用在园艺学上是指无性繁殖的技术。任何DNA片段都能通过先插人质粒或细菌病毒（噬菌体）DNA，然后在细菌细胞中生长而扩增百万倍以上，这个由单一DNA片段复制成许多相同DNA片段的过程称为“DNA克隆”。

3.聚合酶链反应（PCR）技术与DNA扩增

图5-14　聚合酶链反应

聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术，即无细胞分子克隆技术。PCR技术由Mullis于1985年发明，它以待扩增的两条DNA链为模板，由一对人工合成的寡聚核苷酸引物介导，通过DNA聚合酶酶促反应，快速体外扩增特异的DNA序列。由图5-14可见，PCR技术中每轮循环包括变性、复性和延伸3个阶段，约经过30轮循环就可迅速将待扩增的DNA扩增数百万倍。由于PCR技术具有操作简单、快速、特异和灵敏的特点，被认为是20世纪核酸分子生物学研究领域的最重要的发明之一。目前，PCR技术已广泛应用于生物学的各个领域，如基因工程、DNA测序、人遗传病的分类鉴别和诊断、肿瘤发生、诊断和治疗以及法医学等。