目的与载体质粒的连接

实验六　目的DNA与载体质粒的连接

一、实验目的

学习利用T₄DNA连接酶，在体外将目的DNA片段与载体质粒连接的方法;掌握DNA片段的体外连接构建新的重组DNA分子的原理。

二、实验原理

T₄DNA连接酶能够催化互补粘性末端核酸片段的连接，形成完整的DNA分子。同样T₄DNA连接酶也能催化两个平末端DNA的连接。T₄DNA连接酶还可以催化DNA-RNA之间、RNA-RNA之间的连接。T₄DNA连接酶最适温度一般在16℃，4℃也可以作用。连接时间可以过夜，也可以在4h以上，具体应根据说明书进行操作。在Mg²⁺和ATP分子存在下，载体分子的粘性末端与外源DNA的粘性末端互补，在T₄DNA连接酶的催化下连接。一般DNA插入片段的浓度与载体的浓度比在3～10之间。

三、实验仪器、材料和试剂

1.仪器:离心管(0.5mL、1.5mL)，台式高速离心机，微量移液器，枪头(1mL、200μL、10μL)，枪头盒、制冰机和冰盒。

2.材料:PCR产物，T载体或基因组DNA双酶切产物和相同酶切后纯化的pUC19载体。

3.试剂:T₄DNA连接酶。

四、实验步骤

1.连接

(1)PCR产物与pUCm-T载体的连接

由于PCR产物末端带有A，可以与T互补，所以用带T粘性末端的pUCm-T载体与PCR产物连接。连接反应如下:

在一个灭菌1.5mL离心管中:

1μL 10×连接酶缓冲液，1μLT₄ DNA，1μL pUCm-T载体，7μLPCR产物(或4μL PCR产物，2.5μL ddH₂O)。

(2)基因组DNA EcoRⅠ和HindⅢ双酶切产物与回收的pUC19质粒DNA EcoRⅠ和HindⅢ双酶切产物连接

将实验一和实验四用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切的基因组DNA和pUC19质粒产物分别以下列比例和反应体系混合:1∶1，1∶3，3∶1。

1μL10×连接酶缓冲液，1μL T₄DNA，3μL∶3μL或2μL∶6μL，或6μL∶2μL的基因组DNA酶切产物和pUC19质粒酶切产物，总反应体积10μL。用手弹管底混匀后瞬时离心，将盛有连接反应物的管子4℃过夜连接。

2.转化(参照实验七、实验八)

连接反应操作过程需要30min，反应时间4～12h。

五、思考题

进行DNA连接的反应温度为什么采用16℃或4℃?