不同水平对早期断奶犊牛免疫功能的影响

不同水平对早期断奶犊牛免疫功能的影响_责任与使命——宁夏博士研究成果集萃

不同水平Gln对早期断奶犊牛免疫功能的影响

周玉香¹　张培松¹　卢德勋²　孙海洲²

1.宁夏大学农学院动物科学系；2.内蒙古畜牧科学院动物营养研究所

摘　要:选用体重和出生日期相近的12头中国荷斯坦犊牛，随机分为4组，40±1d一次性断奶。采用胃肠外营养（Totalparenteralnutrition，TPN）颈静脉灌注丙氨酰谷氨酰胺（Ala-Gln）二肽的方式，研究了不同水平Gln对早期断奶犊牛免疫功能的影响。Ala-Gln灌注剂量为Ⅰ组（对照组，不灌注），Ⅱ组（低水平） 0.33g/kgBW.d，Ⅲ组（高水平） 1.34g/kgBW.d，Ⅳ组（中等水平） 0.68g/kgBW.d，连续灌注7 d。结果表明:补充中等水平的Ala-Gln，可以有效地增加外周血CD2⁺和CD4⁺淋巴细胞的含量，使CD4⁺/ CD8⁺比值增高，同时使血清IgA和IgG含量和空肠及回肠黏液S-IgA含量显著升高，从而增强了机体的免疫功能。

关键词:早期断奶犊牛　Ala-Gln　免疫功能

Abstract: 12 Chinese Holstein calves with similar weight and date of birth were selected and divided randomly into four groups. They were weaned at 40±1d. Alanyl-glutamine peptide （Ala-Gln） was supplemented through jugular vein by total parenteral nutrition （TPN） , which was used to study the effects of different injected glutamine levels on immune function in early-weaned calves. Ala-Gln levels were designed as follows: trial I （control group, 0g/kg .BW.d），trail II （low-Gln group，0.33g/kg .BW.d），trail III （high-Gln group，1.34 g/kg. BW.d），trail IV （mid-Gln group，0.68 g/kg.BW.d），and the injection lasted for 7d continuously. The results indicated that mid-Gln level could increase effectively peripheral blood’s level of CD2⁺and CD4⁺lymphocyte and the ratio of CD4⁺/CD8⁺. At the same time, the levels of serum IgA, IgG and S-IgA in jejunum and ileum mucus were increased significantly, which could result in improvement of animals’ immune function.

Key words: Early-weaned calves；Ala-Gln；immune function

目前普遍认为肠道是机体最大的免疫器官。肠道这一复杂的免疫系统被称为肠道相关淋巴组织（GALT）。已有研究表明，断奶应激引起动物机体血液Gln含量显著下降^[1～3]。内源性谷氨酰胺减少可导致肠黏膜固有层中淋巴细胞产生分泌性免疫球蛋白（S-IgA）的能力下降，以致中和肠道内毒素的能力下降，增加肠黏膜表面的细菌移位。补充Gln可以维持各种应激条件下淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等正常的免疫反应能力^[4～6]。因此，本试验通过颈静脉灌注不同水平Gln，研究其对肠黏膜的保护作用，以提高肠道的免疫功能，保持动物的健康。

1　材料与方法

1.1　试验动物与饲养管理

选用12头体况良好、健康无疾病、体重和出生日期相近的半同胞中国荷斯坦犊牛进行试验。初乳期为7 d，从第8d开始喂给常乳。犊牛单笼饲养。8～21日龄每天喂4.2kg/头的鲜奶。第22～40日龄每天4.3kg/头鲜奶。全期共用鲜奶140.4kg。40±1d一次性断奶。

试验犊牛单笼饲养，第10 d开始为犊牛提供苜蓿干草和犊牛料任其自由采食。每日饲喂两次。犊牛饮水水温保持在35℃左右。一个月后饮常温水，自由饮水。

1.2　试验设计与处理

采用随机区组试验设计，将12头犊牛随机分为4组，颈静脉灌注4个不同水平的Ala-Gln。具体方法是将丙氨酰谷氨酰胺二肽溶于500ml的生理盐水中高压灭菌，于断奶的当天进行颈静脉连续灌注7 d。断奶后18d屠宰。4个Ala-Gln灌注水平如表1所示。

表1　不同水平Gln灌注剂量

注:中等水平参照Roy^[7]绵羊TPN灌注方法计算。低水平灌注剂量为中等水平的1/2，高水平灌注剂量为中等水平的2倍，对照组只灌注500ml的生理盐水。

1.3　试验日粮

根据NRC （1998）犊牛饲养标准，并结合中国荷斯坦犊牛生产实践配制。犊牛料组成和营养成分见表2。

表2　犊牛料组成及营养水平

注:1.预混料含多种维生素和矿物质；2.增重净能为计算值，其他均为测定值。

1.4　试验方案

犊牛断奶后的第0 d、7 d、14 d颈静脉采血10 ml。其中5 ml肝素抗凝，以进行外周血总T细胞（CD2^＋）、辅助T细胞（CD4⁺）和抑制T细胞（CD8⁺）的测定。另外5 ml装备血清，以测定血清IgA和IgG含量。

试验结束后试验犊牛全部屠宰，取空肠黏液3000转/分离心10分钟，取上清液在－20℃条件下保存备用，测定S-IgA。

1.5　分析方法

血液T淋巴细胞亚群CD2⁺、CD4⁺和CD8⁺的测定，采用流式细胞术法。血清IgA、IgG含量和空肠黏液S－IgA含量的测定，采用放射免疫法。

1.6　数据分析

数据统计分析利用SAS软件包（SAS for Windows，Release 6.12）中的平衡实验设计方差分析过程（ANOVA），均值的多重比较采用Duncan法进行。

2　结果与分析

2.1　不同水平Gln对早期断奶犊牛血液CD2⁺、CD4⁺、CD8⁺和CD4⁺/CD8⁺含量的影响

不同水平Gln对早期断奶犊牛外周血CD2⁺T淋巴细胞数量的影响见表3。断奶前各处理组CD2⁺T淋巴细胞数量差异不显著（P>0.05）。在断奶后的第7d，补充不同水平的Gln组CD2⁺T淋巴细胞数量差异达显著水平（P<0.05），试验Ⅲ组（高水平组）极显著低于试验Ⅰ组、试验Ⅱ组和试验Ⅳ组。在断奶后的第14d，各处理组间CD2⁺细胞含量仍达显著水平（P<0.05），但以补充中等水平的试验Ⅳ组最高，其他各组间差异不显著。

试验Ⅲ组在断奶后第7d时CD2⁺细胞含量极显著降低（P<0.01），14d时极显著升高（P<0.01）。试验Ⅳ组在断奶后7d CD2⁺细胞含量比断奶时有所升高，14d时极显著升高（P<0.01）。

不同水平Gln对早期断奶犊牛7d外周血辅助性T淋巴细胞CD4⁺含量的影响差异不显著（P>0.05），对于14d时外周血CD4⁺细胞含量的影响达差异显著水平（P<0.05），且以试验Ⅳ组最高，其他各组间差异不显著（P>0.05） （见表3）。

各处理组CD4⁺细胞含量在断奶后0d、7d、14d时差异均不显著（P>0.05）。在断奶后的第7d，除试验Ⅲ组CD4⁺细胞含量比断奶时含量降低外，其他各组与断奶前相近或有所增加。断奶后的第14d，试验Ⅲ组CD4⁺细胞比断奶后第7d增加，其他各组基本保持在断奶后第7d的水平。

对于抑制性和杀伤性CD8⁺T淋巴细胞而言，同一日龄各处理组间均差异不显著（P>0.05）。各处理内组内差异也不显著（P>0.05）。说明，CD8⁺淋巴细胞含量的增加较为平缓（见表3）。

CD4⁺/CD8⁺的比值，在断奶后的第7d各处理组间达到了显著水平（P<0.05）。在断奶后的第14d各处理组组间差异不显著（P>0.05），但以试验Ⅳ组最高，试验Ⅰ组最低。

各处理组不同日龄间CD4⁺/CD8⁺的比值，试验Ⅲ组达差异显著水平（P< 0.05）。在断奶后的第7d降低，第14d时升高，而试验Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅳ组在各日龄间差异均不显著（P>0.05） （见表3）。

CD2⁺细胞可以反映外周血T淋巴细胞总数，T淋巴细胞数量增加，可增强机体的免疫力和抗病力。

CD4⁺与CD8⁺的比值是一重要的评估机体免疫状态的依据。在正常情况下，牛CD4⁺/CD8⁺的比值在2.5～4.0^[8]，犊牛为2.38±0.46^[9]。在正常范围内，此比值升高，说明免疫功能增强，反之，免疫功能降低。

日粮中各种营养物质在机体维持最佳免疫状态方面发挥着举足轻重的作用，营养素可以在胃肠道、胸腺、脾脏、淋巴结和循环免疫细胞等水平上，以多种方式对免疫功能进行调节^[10]。任何营养物质的缺乏或摄入过多都会给免疫功能带来危害，增加机体对疾病的易感性^[11]。本试验的结果也证明了这一点。

表3　不同水平Gln对早期断奶犊牛血液CD2⁺、CD4⁺、CD8⁺和CD4⁺/CD8⁺含量的影响

注:同行上角标小写字母不同者为差异显著（P<0.05）。同列括号内大写字母不同者为差异极显著（P<0.01），小写字母不同者为差异极显著（P<0.05）。

2.2　不同水平Gln对早期断奶犊牛血清IgA和IgG含量的影响

不同水平Gln对早期断奶犊牛血清IgA含量的影响见表4。在断奶后的7 d和14 d各处理组组间差异达极显著水平（P<0.01）。在断奶后7 d试验Ⅳ组血清IgA含量最高，其次是试验Ⅱ组，试验Ⅰ组最低，试验Ⅰ组、试验Ⅱ组和试验Ⅲ组间差异不显著（P>0.05）。在断奶后14 d，与其他各组相比，试验Ⅳ组仍保持高的血清IgA水平，而试验Ⅲ组血清IgA水平却明显降低且低于试验Ⅰ组。

试验Ⅰ组、试验Ⅱ组和试验Ⅲ组各处理不同日龄间差异均不显著（P>0.05）。试验Ⅳ组不同日龄间差异显著（P<0.05）。

断奶时血清IgG含量相同的早期断奶犊牛，通过颈静脉灌注不同水平的Ala-Gln后，在断奶后的第7 d各处理组血清IgG含量差异极显著（P<0.01），其中试验Ⅳ组和试验Ⅱ组显著高于试验Ⅰ组和试验Ⅲ组。在断奶后的第14 d各处理组血清IgG含量差异不显著（P>0.05） （见表4）。

表4　不同水平Gln对早期断奶犊牛血清IgA和IgG含量的影响（mg/100ml）

注:1.同列上角标小写字母不同表示差异显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）；2.同行上角标小写字母不同表示差异显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）。

各处理组不同日龄间只有试验Ⅲ组达差异极显著水平（P<0.01），在断奶后的第7 d血清IgG含量显著低于断奶前的水平，至断奶后的第14 d达断奶前的水平。试验Ⅰ组断奶后在第7 d血清IgG含量比断奶前降低，但未达统计学上的差异显著水平，在断奶后的第14 d各处理组血清IgG含量达到断奶前的水平。试验Ⅱ组和试验Ⅳ组各日龄间血清IgG含量差异不显著（P>0.05），且在断奶后第7 d和14 d基本保持在断奶前的水平。

由此可知，补充适宜量的Gln能有效地改善早期断奶犊牛体液免疫状况。补充高水平的Gln对早期断奶犊牛并非有利，也就是说早期断奶犊牛对Gln的需要量是有一定限度的。

2.3　不同水平Gln对早期断奶犊牛小肠黏液S-IgA含量的影响

如表5所示，不同水平Gln对早期断奶犊牛十二指肠、空肠和回肠黏液S-IgA含量的影响均达到了差异极显著水平（P<0.01）。除十二指肠黏液S-IgA含量试验Ⅳ组低于其他组外，试验Ⅳ组空肠和回肠黏液S-IgA含量均高于其他各组。

表5　不同水平Gln对早期断奶犊牛小肠黏液S- IgA含量的影响（mg/ml）

注:同行上角标小写字母不同表示差异显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）。

Newahole^[12]报道，Gln缺乏能明显降低肠腔中S-IgA的含量，与肠黏膜内可分泌S-IgA的浆细胞数量减少有关。Bruke等^[13]研究了接受全肠外营养（TPN）动物肠道免疫功能的变化，发现没有加入Gln的动物，胆汁中S-IgA的分泌下降了50%，细菌大量黏附于黏膜表面，肠系膜淋巴结中有明显细菌移位；而在肠外营养中加入Gln的动物，胆汁中S-IgA水平与正常动物相比无差异，肠黏膜浆细胞计数也证实Gln能阻止产生S-IgA细胞的减少。另有研究表明，未加入Gln的TPN组的动物胆汁中S-IgA明显下降，IgA阳性的浆细胞也明显减少，另外，CD4⁺、CD8⁺的淋巴细胞也急剧下降，而在TPN液中加入Gln的动物B、T细胞均与正常动物无差异。

S-IgA最主要的保护作用是阻止细菌对肠上皮细胞的黏附，S-IgA的这种功能是其他免疫球蛋白的7～10倍。研究表明，Gln与肠道黏膜免疫系统的主要活性物质—分泌型IgA （S-IgA）有直接关系。Gln能增加产生S-IgA的细胞。分泌型IgA对机体呼吸道、消化道等局部黏膜免疫起着相当重要的作用，特别是对于一些经黏膜感染的病原微生物，动物体的这种黏膜免疫功能就显得十分重要。若动物体呼吸道、消化道分泌液中存在这些病原微生物的相应的分泌型IgA抗体，则可抵抗其感染，因此分泌型IgA是机体黏膜免疫的一道“屏障” 。

总之，大量研究结果表明，Gln是GALT的维持、S-IgA合成和阻止细菌移位的一种重要氨基酸。

3　结论

①补充中等水平的Gln，可以有效地增加外周血CD2⁺和CD4⁺淋巴细胞的含量，使CD4+/CD8+比值增高，从而增强了机体的免疫功能。

②补充中等水平的Gln后，可以增强早期断奶犊牛的体液免疫功能，使血清IgA和IgG含量显著升高。

③补充中等水平的Gln，使早期断奶犊牛空肠和回肠黏液S-IgA含量显著提高，从而使肠道免疫功能显著改善。

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