实验十 对流免疫电泳
实验目的
掌握双向免疫电泳的原理、基本方法及临床用途(以检测患者血清中HbsAg为例)。
实验原理
对流免疫电泳是将双向免疫扩散实验与电泳相结合的一种技术。在pH值为8.6的电解质中,大部分抗原带负电荷,分子小,虽然受电渗的影响但仍向阳极移动,而抗体等电点较高,只带有微弱的负电荷,而且分子较大,受电渗的影响大,电泳时向阴极移动,二者相向运动,一定时间后相遇,于比例适宜处形成肉眼可见的沉淀线。
实验材料
(1)待检血清。
(2)抗HBs免疫血清、HbsAg阳性对照血清。
(3)15g/L的盐水琼脂,微量移液器,载玻片,打孔器,吸管,湿盒,0.05mol/L pH值为8.6的巴比妥缓冲液,电泳槽,电泳仪等。
实验方法
(1)吸取融化的15g/L盐水琼脂4mL左右,浇注在载玻片上,琼脂厚度为2~3 mm,冷却凝固。
(2)用3mm打孔器打孔,孔间距10mm,如图3-5所示。将琼脂板置于电泳槽架上,两端贴上已浸透缓冲液的滤纸(至少2层),滤纸与琼脂接触部分应在0.4~0.7cm,平整无气泡。滤纸下端进入电泳槽内至少2~3cm。
(3)用微量加样器分别取抗HBs的免疫血清10μL、待检血清10μL,加入阴极1号孔和2号孔,取HbsAg阳性对照血清加入阳极3号孔和4号孔,每孔10μL。
图3-5 对流免疫电泳抗原抗体孔示意图
(4)接通电源,控制电压在4~6V/cm(玻片长度),电泳时间以阳性对照抗原抗体间出现沉淀线后5~10min为宜,一般为40~60min。
(5)调整电压为零,切断电源,取出琼脂板,观察实验结果。
实验结果
待检孔与抗体孔间出现与阳性对照相似的沉淀线,即为阳性,否则为阴性,如图3-6所示。若沉淀线不清晰,可将琼脂板置于湿盒内于37℃或室温放置数小时,清晰度有时可以增强。
图3-6 对流免疫电泳实验结果示意图
注意事项
(1)若抗原抗体均为免疫球蛋白,或电泳迁移率相近,不能用做对流免疫电泳检查。
(2)电泳时,用于搭桥的滤纸要与玻片完全贴紧、无气泡。
思考题
(1)如果将抗原放在阳极端,抗体放在阴极端,会不会出现沉淀线?为什么?
(2)试比较对流免疫电泳实验和双向琼脂扩散实验的优缺点。
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