自体造血干细胞移植采集过程

第五节　干细胞移植

一、概述

干细胞(stem cell)是人体的起源细胞，具有自我更新和多向分化潜能的能力。所谓自我更新即细胞通过有丝分裂产生的2个子代细胞仍具有分裂前的增殖和发育潜力。所谓多向分化，即它们具有相同的向多种细胞发育的潜力，只是由于单个干细胞所处的微环境不同，受控于不同的调节系统才发育成不同的后代。干细胞由受精卵发育分化而来，最初形成原始胚胎干细胞，然后分化增殖为能形成人体各种组织的全能干细胞，并逐步分化为亚全能、多能干细胞，最终分化为具有特定功能的组织专能干细胞。早期胚胎中的原始生殖细胞具有广泛的发育潜力，称全能干细胞，它一旦分化为多能干细胞，其分化就受限于所在的器官系统。严格说来只有受精卵最初几次分裂产生的子代符合上述标准，它们具有发育成为机体中各种器官细胞的潜能，称之为全能干细胞(totiopotent stem cell)。

在造血组织中，存在有血液、血管和间质三种组织的干细胞，分别称为造血干细胞(hematopoietic stem cell，HSC)、血管干细胞(angiolast)和间质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)。HSC和血管干细胞又来自一共同的干细胞，称原血干细胞或血液血管干细胞(hemangioblast)。这些干细胞在胚胎早期集中在卵黄囊和主动脉—性腺—中肾区(aorta－gonal－mesoneph site，AGMS)，出生后人体内哪些组织器官存在原血干细胞尚待明确。

造血干细胞是造血系统细胞的鼻祖，它具有向各种髓细胞和淋巴细胞发育的潜能，同时也具有一定的自我更新能力，可通过移植重建受损的造血系统和免疫系统，也称之为多能干细胞(multipotent stem cell)。根据细胞发育的连续性，多能的造血干细胞只是干细胞池的一个发育阶段，它来自全能干细胞，又通过增殖分化逐渐减弱其自我更新和分化潜能，最终失去干细胞特征，成为没有自我更新能力和发育方向限定的造血祖细胞。目前研究已证实多能的造血干细胞来源于全能干细胞。过去认为这种细胞只有向生殖细胞发育的能力，称之为原始生殖细胞(proimordial germ cells，PGC)。以后许多研究发现PGC表达阶段特异性胚胎抗原1(stage specific embryonic antigen－1，SSEA－1)，是胚胎中唯一的碱性磷酸酶阳性细胞，它们在体外培养增殖能力极强，并能分化为许多不同的细胞类型，包括造血细胞。研究结果证明无论来自胚外或胚胎的PGC都有发育成造血细胞的能力，造血干细胞来源于发育中的胚胎。

造血干细胞移植已有40多年历史，近20余年在治疗血液系统恶性疾病、实体瘤、先天性代谢疾病、免疫性疾病等方面起到重要作用。根据造血干细胞供体与受体基因型的差别，造血干细胞移植分为自体移植、同基因移植和异基因移植等。

二、自体造血干细胞移植

自体造血干细胞移植(autologous hematopoietic stem cell transplantation，AHSCT)是指在特定时期采集患者自身的造血干细胞，在体外保存或特殊处理(如净化、转基因等)，并于患者接受高剂量化疗或放疗后回输，以促进造血恢复或造血重建。自体造血干细胞移植目前已广泛应用于治疗造血系统恶性肿瘤和实体瘤超大剂量化放疗后的骨髓抑制，也用于一些非恶性疾病的治疗。

与异基因造血干细胞移植比较，自体造血干细胞移植有其优缺点。主要优点为:①自体造血干细胞移植不受HLA配型限制，不存在寻找配型相合的有关或无关供者的问题，因此在病例选择上具有明显优势;②不存在移植物抗宿主病(graftversus－host disease，GVHD)，预处理方案仅需针对原发病，不需要抑制受体的免疫系统，不必采用预防和治疗GVHD的措施，白细胞和血小板恢复期短，移植并发症和相关死亡率较异基因造血干细胞移植明显降低;③患者对自体造血干细胞移植的耐受性较高，移植年龄限制较异基因造血干细胞移植宽松，老年患者也可接受自体移植;④住院时间和费用较异基因造血干细胞移植低。主要缺点为:①所采集的造血干细胞受肿瘤细胞“污染”，无论是造血系统恶性肿瘤还是实体瘤，无论移植的造血干细胞是来源于骨髓还是来源于外周血，所移植的细胞均可能含有少量的肿瘤细胞，回输给患者后可能造成肿瘤复发;②不存在移植物抗肿瘤作用(graft－versustumor response，GVTR)，GVTR是清除移植后体内残存的微小病灶的重要机制，对一些肿瘤如慢性粒细胞白血病尤为重要，自体造血干细胞移植由于缺乏GVTR作用和可能存在的肿瘤细胞污染，移植后的复发率明显高于异基因造血干细胞移植;③患者骨髓由于受到肿瘤侵犯和化放疗抑制，使所采集的造血干细胞的数量和质量受影响，导致移植后造血重建延迟;④遗传性疾病由于造血干细胞存在基因缺陷，不能采用自体造血干细胞移植治疗。

根据造血干细胞的来源，自体造血干细胞移植分为自体骨髓移植和自体外周造血干细胞移植。外周造血干细胞采集简便，患者不需麻醉，对骨髓已有转移或接受放疗造成损害的患者也可采集，造血重建比骨髓移植快。目前进行自体外周造血干细胞移植的数量明显超过自体骨髓移植，有取代自体骨髓移植的趋势。1997年欧洲的14 989例自体移植中，仅5%为自体骨髓移植，95%为外周造血干细胞移植，二者在疗效上并无显著差别。

与异基因造血干细胞移植相同，自体造血干细胞移植使联合化疗的剂量限制性毒性由骨髓毒性转变为其他器官的毒性，从而使化疗药物的剂量较常规剂量提高2～10倍。例如，预处理方案常用的药物足叶乙甙和苯丙氨酸氮芥的剂量限制性毒性由骨髓抑制转为黏膜炎，环磷酰胺则转为心肺毒性和出血性膀胱炎。用超大剂量化疗治疗肿瘤有利于克服肿瘤耐药，提高疗效，故此当肿瘤对化疗药物敏感，疗效与化疗剂量的量效关系曲线陡直，所用药物的髓外器官毒性较小的情况下，为自体造血干细胞移植的良好适应证。

自体造血干细胞移植可应用于多种造血系统恶性肿瘤和实体瘤的治疗。常用于急性白血病、预后指标为中危和高危的恶性淋巴瘤、复发和原发耐药的低度恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、高危的原发性乳腺癌或转移性乳腺癌、卵巢癌、小细胞肺癌等。尽管认为经过选择的病例中自体造血干细胞移植有效率和长期生存率优于常规化疗，目前仍需要进行大规模的前瞻性随机对照研究证实自体造血干细胞移植的确切地位。自体造血干细胞移植也在临床试验中用于治疗严重的自身免疫性疾病包括多发性硬化病、系统性硬化病、类风湿关节炎、青少年特发性关节炎、系统性红斑狼疮、皮肌炎/多发性肌炎等，其中多发性硬化病、系统性硬化病和类风湿关节炎已进行前瞻性随机对照Ⅲ期临床试验，对于青少年特发性关节炎、系统性红斑狼疮等还需要进一步的Ⅰ期和Ⅱ期临床试验资料。

自体造血干细胞移植今后的发展在于克服目前存在的缺陷。目前研究较多的有:①通过物理、化学和生物学的体外净化方法消除肿瘤细胞污染，其中应用较多的是单克隆抗体阳选法，但其临床应用

价值有待进一步评价;②通过体外培养提高造血干细胞的数量和质量，以提高植入率和缩短骨髓抑制期，已有临床应用的报告显示回输经体外扩增的CD+ 34细胞可以缩短中性粒细胞的恢复时间，回输体外扩增的巨核细胞可以减少血小板的输注;③通过造血干细胞体外转基因技术导入多药耐药基因，提高骨髓对化疗的耐受性，达到提高化疗剂量、提高疗效的作用;④通过将正常基因导入存在基因缺陷的造血干细胞，用于治疗基因缺陷的遗传性疾病，如血红蛋白病、范可尼贫血等。在提高移植物抗肿瘤作用方面，目前也正进行大量的研究。NK细胞具有抗肿瘤效应，但在一般情况下采集的单个核细胞中这类细胞数量很少。改进造血干细胞动员方案，如在方案中加入IL－2可以提高NK细胞和活化的T淋巴细胞的产量，提高GVTR的效应。利用细胞因子(IL－2，IL－12，IL－15等)在体外增殖和激活效应细胞(NK，LAK，CTC等)，再回输给患者，可以起到抗肿瘤的作用。将自体骨髓与IL－2在体外孵育，其中的淋巴细胞被激活并溶解肿瘤细胞，可以得到体外净化和GVTR的效果。利用血细胞分离机单采淋巴细胞与淋巴细胞因子体外孵育数天，于自体造血干细胞移植后回输，有利于清除体内的微小残余病灶，降低复发率。

三、异基因干细胞移植

异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，Allo－HSCT)的供体可为亲属供者、无关供者和脐血等。由于供者基因型与受体不完全相同，为使移植成功必须确保供者干细胞植入受体造血微环境重建造血与免疫系统并且不发生致命的移植物抗宿主病(graft－versus－host disease，GVHD)，因此选择供者时要求供者与受体的组织配型尽可能一致。主要组织相容性抗原(major histocompatibility complex，MHC)由6号染色体编码，Ⅰ型MHC有3个位点编码HLA－A、HLA－B和HLA－C，Ⅱ型MHC有HLADR、HLA－DP和HLA－DQ。移植的成功率与HLA匹配程度有关，HLA配型程度越低，移植物被排斥和严重的GVHD的发生率越高。此外，次要组织相容性抗原也影响移植成功。MHC位点全部相同的亲属供者移植的成功率最高。

异基因造血干细胞移植抗肿瘤作用一方面通过大剂量化放疗杀灭肿瘤细胞，另一方面，越来越多的证据证实移植物抗肿瘤作用(GVTR)在清除受体体内微小残余病灶、降低细胞肿瘤复发起到重要作用。GVTR主要由供者T淋巴细胞介导。临床研究证实含T细胞的异基因移植后患者体内的微小残余病灶能被逐渐清除，合并GVHD患者的复发率降低，而去除T细胞的异基因移植和同基因异体移植复发率增高。移植后复发的患者经供者淋巴细胞输注(DLI)后仍可诱导缓解。说明GVTR在肿瘤的治疗方面起重要作用。动物试验和临床资料显示GVTR对急、慢性白血病，NHL、MM和多种实体瘤如乳腺癌、肾细胞癌、神经母细胞瘤及软组织肉瘤等均有效。GVTR作用在慢性粒细胞性白血病的治疗中尤其重要。

GVHD为Allo－HSCT的主要并发症，是供者的免疫效应细胞攻击受体组织造成的损害。GVHD亦由供者T淋巴细胞介导。供者与受体之间的MHC差别是发生GVHD的主要原因，此外次要组织相容性抗原配型不合、感染、预处理造成的组织损伤均可诱发或加重GVHD。GVHD主要通过药物如环孢素A、糖皮质激素、MTX等治疗和预防，去除细胞的移植可防止或减轻GVHD。

Allo－HSCT是治愈CML的唯一手段，配型相合的同胞供者移植的长期无病生存率超过70%。成人急性白血病首次缓解，儿童高危急性淋巴细胞白血病首次缓解和标危急性淋巴细胞白血病第2次缓解是Allo－HSCT的适应证，但较高的移植相关毒性和复发率在一定程度上抵消了Allo－HSCT的优势。同样由于移植相关死亡率高，Allo－HSCT在多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤和实体瘤的治疗中不作为首选。非肿瘤疾病中，Allo－HSCT在重型再生障碍性贫血、重型地中海贫血、联合免疫缺陷病、骨髓增生异常综合征、原发性骨髓纤维化的治疗上占重要地位。

Allo－HSCT的临床应用受到一些因素的限制。有限的供者来源使大多数患者无法接受Allo－HSCT。骨髓库和脐血库的建立为缺乏配型相合亲属供者的患者提供无关供者移植，多年来，无关供者移植的GVHD发生率和相关死亡率较同胞供者明显增高。但近10年来随着组织配型技术的改进，经过精确配型相合的无关供者移植的成功率接近配型相合的同胞供者移植。近年在半相合亲属供者移植方个位点以上不合方面取得一定进展，但2个位点以上不合的移植仍合并很高的植入失败和GVHD，仅作为需要紧急移植又无合适供者的选择。移植相关毒性是Allo－HSCT应用受限的另一重要因素，由于预处理的强度、大毒性高，GVHD的危险性增加。异基因的合并症和移植相关死亡率高，在低度恶性NHL中TRM达30%以上，有报道在MM中高达70%，使其临床应用明显受限。国内仅用于45岁以内(国外55岁以内)、一般情况良好、无脏器功能损害的年轻患者，多数肿瘤患者被排除在外。近几年提出的非清髓性异基因造血干细胞移植(nonmyeloablative stem cell transplantation，NST)保留异基因移植的GVTR作用，同时降低移植相关毒性。NST预处理的重心由利用超大剂量化放疗抗肿瘤作用转移至对宿主的免疫抑制以保障移植物的植入，预处理方案的强度明显降低，并不完全清除宿主造血细胞，而通过供者T淋巴细胞在NST后数个月的过程中清除宿主造血细胞和残留的肿瘤细胞。由于NST预处理的毒性降低，合并症和与毒性有关的急性GVHD发生率降低，TRM降低，治疗的安全性增高。临床试验报道以NST和随后的供者淋巴细胞输注(DLI)使绝大多数患者获得稳定的异基因造血，在恶性血液病如白血病、淋巴瘤、MM、MDS等和实体瘤如乳腺癌、肾癌、肠癌均有成功治疗的报道。临床资料显示NST的毒性较传统的异基因HSCT明显降低。Slavin总结100余例NST病例，患者年龄3～63岁，总的TRM仅4%，与自体移植相近。老年患者也能安全接受NST，Girali以NST治疗55～75岁的老年白血病和MDS患者，91%患者移植成功，TRM仅20%，急、慢性GVHD分别为32%和52%，88%的患者获得完全缓解，2年无病生存率为52%。毒性和疗效均可被临床所接受。

建立和发展国际骨髓库和脐血库有助于使更多的患者得益于异基因造血干细胞移植，从细胞和分子生物学方面深入了解GVL和GVHD的机制的异同将更有效地防治GVHD并发挥异基因移植的抗肿瘤效应。

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