吞噬细胞功能测定

二、吞噬细胞功能测定

吞噬细胞的吞噬过程大致分为趋化、吞噬和胞内杀灭作用三个阶段，可分别对这三个阶段进行功能检测。

（一）中性粒细胞功能测定

1.趋化功能测定　中性粒细胞在趋化因子如微生物的细胞成分及其代谢产物、补体活性片段C5a、C3a、某些细胞因子等的作用下产生趋化运动，其趋化运动强度可反映中性粒细胞的趋化功能。常用琼脂糖凝胶板法检测。

【原理】

在趋化因子的吸引下，中性粒细胞作定向移动。根据其在琼脂糖凝胶板上移动的距离，即可判断其趋化功能。

【试剂与器材】

（1）趋化因子、白细胞悬液、15.0 g/L琼脂糖、RPM I 1640培养基、甲醇等。

（2）温箱、湿盒、载玻片、打孔器、测微器等。

【操作方法】

（1）融化琼脂糖胶液，水浴中冷至56℃，加入等体积的RPM I 1640培养基（预温至56℃）和灭活小牛血清（最终浓度为10％）及适量青霉素、链霉素，混匀。

（2）于每块洁净载玻片上浇注上述凝胶液3 mL，置4℃30 min使之充分凝固。每份检样打孔3个，按左、中、右排列，孔径3 mm，孔距2 mm。

（3）左孔加趋化因子，中孔加白细胞悬液，右孔加对照培养基1 640，加样量均为10μL。

（4）将载玻片置湿盒内，在含5％ CO₂的环境中，37℃温育3 h或4～8 h。

（5）将载玻片浸于甲醇中30 min，剥除凝胶膜，用吉姆萨染液染10 min，镜检。

【结果判断】

测量白细胞向左侧孔移动的距离即趋化移动距离（A）和向右侧孔移动的距离即随机移动距离（B），计算趋化指数（A/B），判断细胞的定向移动能力（图8-3）。通常新生儿的趋化指数为2.0～2.5；成人的为3.0～3.5。

图8-3　白细胞趋化运动示意

【注意事项】

（1）应通过预实验选择趋化因子和白细胞悬液的最适浓度。

（2）浇注琼脂糖凝胶板时应在水平台面上进行，以保证凝胶板厚度均匀。

【临床应用】

该法主要测定中性粒细胞定向移动的能力，从而判断其吞噬功能。

2.吞噬与杀菌功能测定

（1）显微镜检查法　将白细胞与葡萄球菌或白色念珠菌悬液混合温育，涂片，固定，碱性亚甲蓝染色。在油镜下观察吞噬细胞对细菌的吞噬情况，计算吞噬细菌和未吞噬细菌的白细胞数。对有吞噬作用的白细胞，应同时记录所吞噬的细菌数。按下式计算吞噬率：

吞噬率（％）=（吞噬细菌的白细胞数/计数的白细胞数）×100％

另外，碱性亚甲蓝染料仅能使死亡细菌着色，而活菌对其排斥，因此可根据被吞噬的细菌是否着色测定杀菌率。

杀菌率（％）=（胞内含着染菌体的细胞数/吞噬细菌的白细胞数）×100％

（2）溶菌法　将白细胞悬液与经新鲜人血清调理过的细菌（大肠杆菌或金黄色葡萄球菌）按一定比例混合，温育。每隔一定时间取定量培养物，稀释后接种固体平板培养基。37℃培养18 h后，计数生长菌落数，以了解中性粒细胞的杀菌能力。

杀菌率（％）=（1-作用30、60、90 min菌落数/0 min菌落数）×100％

（3）NBT还原试验　中性粒细胞在吞噬杀菌过程中，能量消耗剧增，耗氧量也随之增加，磷酸戊糖旁路的代谢活性增强，6-磷酸葡萄糖脱氢酶使葡萄糖的中间代谢产物6-磷酸葡萄糖氧化脱氢酶转变为戊糖。如加入硝基蓝四氮唑（NBT），则可被吞噬或渗透到中性粒细胞胞质中，接受所脱的氢，使原来呈淡黄色的NBT还原成点状或块状的蓝黑色甲臜颗粒，沉积于中性粒细胞胞质中，呈NBT阳性细胞。NBT阳性细胞百分率可反映中性粒细胞的杀菌功能。常用的刺激物有细菌内毒素和胶乳颗粒等。

（二）单核-巨噬细胞吞噬功能测定

【原理】

单核-巨噬细胞对颗粒性抗原物质具有很强的吞噬功能，将待测的单核-巨噬细胞与某种可被吞噬而又易于计算的颗粒，如鸡红细胞（CRBC）、白色念珠菌、酵母菌细胞等作用后，根据吞噬细胞吞噬颗粒物质的多少，可计算出吞噬率和吞噬指数，粗略了解单核-巨噬细胞的吞噬功能。

【试剂与器材】

（1）CRBC悬液　自鸡腋下静脉或心脏采血，Alsever（或血库ACD保存液）抗凝并保存，置4℃可有效保存1个月，临用前将CRBC用生理盐水洗涤3次，配成5×10⁶RBC/mL悬液。

（2）斑蝥乙醇浸液　称取中药斑蝥1 g，研磨后加入无水乙醇10 mL，置室温浸2～4 d，用滤纸或多层纱布过滤，可得100 g/L斑蝥乙醇浸液。

（3）显微镜、温箱、载玻片、纱布、滤纸等。

【操作方法】

（1）收集单核-巨噬细胞　将约1 cm²的滤纸片在斑蝥乙醇液中浸湿，贴在受试者前臂内侧皮肤上；覆盖一块塑料薄膜，用无菌纱布固定，4 h后去除滤纸和薄膜，在皮肤红肿处罩上一个拱形小盒盖，用胶布固定，纱布覆盖48 h后取下盒盖，可见形成的皮泡。以无菌操作抽出泡内液（内含单核-巨噬细胞）0.5～1.0 mL，注入离心管。

（2）吞噬试验　取洗过的CRBC悬液0.01 mL加于泡液中混匀，37℃温育30 min，每10 min摇动一次。1 500 r/min离心5 min，弃上清液。取沉淀物混匀，涂于载玻片上制成薄膜晾干。甲醇固定，吉姆萨染色，油镜下观察。

【结果判断】

计数200个单核-巨噬细胞，计算吞噬率和吞噬指数，并通过观察鸡红细胞的消化程度，判断其消化功能。

吞噬率（％）=（吞噬CRBC的细胞数/200）×100％

吞噬指数=细胞中吞噬CRBC总数/200

消化程度分3级：①未消化，CRBC核清晰，浅紫红色，胞质浅红或黄绿色。②轻度消化：CRBC核模糊、肿胀，紫蓝色，胞质浅黄绿色。③完全消化：CRBC核溶解，染色极淡，胞质中间空泡。

【注意事项】

斑蝥敷贴法对皮肤有一定的损伤，有时会引起局部感染，应慎用。

【临床意义】

通过计算单核-吞噬细胞的吞噬率和吞噬指数来判断该细胞吞噬抗原异物的能力，通过观察鸡红细胞的消化程度来判断巨噬细胞的消化功能，从而判断机体免疫能力的强弱及所处的免疫状态。

知识与技能拓展

巨噬细胞促凝血活性测定

激活的巨噬细胞可产生一种与膜结合的凝血活性因子，加速正常血浆的凝固。取已经37℃预温的正常的兔血浆和CaCl₂混合液，加入经黏附有单层巨噬细胞的试管中，移至37℃，记录血浆凝固时间。实验证明当巨噬细胞与LPS、肿瘤相关抗原或HBsAg等温育后，可见血浆凝固时间明显缩短。本法稳定方便，是检测不同疾病患者巨噬细胞功能的指标之一。

思考题

分离PBMC时，离心前应注意将抗凝血与淋巴细胞分层液保持清楚的界面，否则将影响分离效果，分析其原因。

（张洁莉）