第十五章 γ－δT细胞与分枝杆菌感染
T细胞通常不识别游离的抗原，而是识别由抗原呈递细胞所提呈已被处理的抗原多肽，而且这一识别过程受到M H C的限制。这样T细胞与抗原呈递细胞或靶细胞之间形成了一个由T细胞表面的T细胞受体（TCR）、抗原肽和M H C分子组成的复合体。这种复合体启动的免疫识别，最终激活T细胞，这一过程依赖于TCR和分化抗原CD3共同组成复合结构。大多数的T细胞上有一由α和β链组成的异二聚体，少数外周T细胞上带有由γ和δ链组成的异二聚体，称为γ－δT淋巴细胞。此种细胞能识别分枝杆菌抗原。对于这一类型T细胞的了解多来自有关其对分枝杆菌应答反应的研究。
一、γ－δT细胞对分枝杆菌的反应性
Janis等在小鼠模型中的研究中发现，用结核分枝杆菌攻击后小鼠的原发性应答为γ－δT淋巴细胞的明显增殖。此外，O Brien等证实γ－δ胸腺细胞在发育过程中已经前程序化至可与分枝杆菌发生反应。Augustin等证实小鼠接触了气溶胶化的结核分枝杆菌后，γ－δT淋巴细胞在肺脏中增殖。Holoshitz等报告在人类中γ－δT细胞对分枝杆菌的反应性。他们在类风湿关节炎病人关节内分离出对分枝杆菌发生反应的γ－δT细胞。Modlin等鉴定了麻风病变中的分枝杆菌反应性γ－δT细胞。Haregewoin等则在结核菌素试验阳性个体血液中发现PPD反应性γ－δT细胞。Kabelitz等报告PPD阴性正常个体血液中对结核分枝杆菌起反应γ－δT淋巴细胞的反应性以及脐血中γ－δT细胞对分枝杆菌抗原的增殖反应。有关人类γ－δT淋巴细胞的研究结果表明，这种T淋巴细胞也可对其他许多非分枝杆菌感染因子发生反应，如李斯特菌、链球菌、葡萄球菌、沙门菌、大肠埃希菌、疟原虫、疱疹病毒和利什曼原虫。
二、γ－δT淋巴细胞在分枝杆菌疾病中的作用
在以分枝杆菌攻击或感染的早期，可发现有γ－δT淋巴细胞的聚集。用结核分枝杆菌攻击小鼠或以BCG感染小鼠3周后即可见到γ－δT淋巴细胞增殖。在人类中已证实了γ－δT淋巴细胞在麻风发病机制中的作用：第一，TCR－γ－δT淋巴细胞在新近形成肉芽肿的麻风病人T淋巴细胞群体中占有较高的比率（20%～35%）。第二，麻风病变处的γ－δT淋巴细胞可在体外表现针对分枝杆菌抗原的增殖反应。Fijita等不但在麻风病变中发现有γ－δT淋巴细胞的聚集，而且证实其出现的动力学与肉芽肿形成的发生及在肉芽肿完全形成后γ－δT淋巴细胞百分率下降相一致。
结核病人外周血中γ－δT淋巴细胞研究结果不一致。Ito等人报告，结核病人γ－δT淋巴细胞所占的百分比较之健康对照者或细菌性肺炎病人略有增加。但另有两项研究发现，肺结核、胸膜结核和粟粒性结核病人外周血中单个核细胞中的γ－δT淋巴细胞百分比和绝对数均未见有增加。对于γ－δT淋巴细胞存在于疾病部位的观察结果也不肯定。早期研究报告在两例结核性淋巴结炎病人淋巴结中γ－δT淋巴细胞较为明显，但是以后的一个报告中表明4例结核病人淋巴结中γ－δT淋巴细胞的比例极低。另有一报告8例结核性胸膜炎病人的胸腔积液中未见有γ－δT淋巴细胞的增殖。因为一般认为γ－δT淋巴细胞在原发性免疫应答中起作用。所以在原发性结核病人中判断疾病不同部位中细胞的类型是很重要的。
为了探讨对分枝杆菌发生反应的T淋巴细胞是否在结核病的发病机制上起作用，Barnes等检查了各种类型病人中γ－δT淋巴细胞对结核分枝杆菌发生反应的能力，发现γ－δ＋T淋巴细胞在体外培养约10天以后，对感染具有保护性和有抵抗性免疫应答的病人（结核菌素阳性的结核性胸膜炎病人）这类细胞的百分比，较之免疫无效者（晚期肺结核和粟粒性结核病人）为高。结核分枝杆菌诱发γ－δT淋巴细胞的增加是由于γ－δT淋巴细胞的增殖和绝对数量的增加。有些有严重结核病表现的病人，其α－βT淋巴细胞应答表现正常，但γ－δT淋巴细胞应答则不正常，提示γ－δT淋巴细胞在人类结核感染的免疫抵抗力中起作用。这类T淋巴细胞抗原反应性的丧失与分枝杆菌进行性感染的发生有关。
三、γ－δT淋巴细胞的功能
重要的问题是阐明γ－δT淋巴细胞在分枝杆菌免疫应答中的功能。由于这一细胞类型与感染中的主动肉芽肿形成有关，故应确定它们是否与肉芽肿炎症的关系。如用抗CD3抗体刺激感染病变中的γ－δT淋巴细胞并收集其培养上清液，上清液中加入GM－CSF时可诱发巨噬细胞黏附、聚集和增殖，这些过程都是肉芽肿反应所必需的。这一效应可被中和性抗TNFα抗体所阻抑和被重组TNFα所替代，提示γ－δT淋巴细胞所产生的TNFα在肉芽肿的形成上起作用。
为了确定分枝杆菌反应性γ－δT淋巴细胞是否能分泌特定的细胞因子，可用抗CD3单克隆抗体、丝裂原或抗原刺激新鲜分选的γ－δT淋巴细胞和分枝杆菌反应性γ－δT淋巴细胞细胞株，并检测上清液中细胞因子含量。结果发现，新分选的γ－δT淋巴细胞能分泌IL－2和IFN－γ，但不能分泌IL－4；分枝杆菌反应性γ－δT淋巴细胞细胞株则可分泌IFN－γ和TNFα，这两种细胞因子很可能在巨噬细胞活化、肉芽肿形成以及分枝杆菌的消灭中起作用。此种细胞产生IL－2，IL－4，IL－5和IL－10的情况不恒定，表示这些细胞产生细胞因子程式的多样性。由于同一个体中分枝杆菌反应性α－βT淋巴细胞也分泌相同的细胞因子程式，γ－δT淋巴细胞的抗结核防御机制上的特异作用可能并非仅限于其产生特定细胞因子的能力。
分枝杆菌反应性γ－δT淋巴细胞的另一功能特征为其抗原特异性细胞毒作用。可用结核分枝杆菌刺激γ－δT淋巴细胞，然后检测其裂解抗原致敏靶细胞的能力；这些细胞株具有能裂解结核分枝杆菌致敏的靶细胞，而且在某种情况下，能发生交叉反应，裂解其他病原体致敏的靶细胞。
四、γ－δT淋巴细胞识别的抗原
γ－δT淋巴细胞所识别的抗原与α－βT细胞所识别者有所不同。关于这方面的研究主要集中于热休克蛋白和一些新型抗原的生化特性的研究。其中也间接地通过TCR群体分析进行研究。
（一）γ－δT淋巴细胞识别热休克蛋白的事实
热休克蛋白（Hsp）的一种显著特点为其在各种病原体中的同源性。针对此种蛋白质的反应性，特别是交叉反应性表位，有利于γ－δT淋巴细胞识别从未接触过病原体的能力。因为这些抗原存在于小鼠和人类，免疫应答亦可识别以及对感染的宿主细胞发生反应，包括在巨噬细胞上诱生的热休克蛋白。
有人从以福氏佐剂免疫小鼠淋巴结和以气溶胶化分枝杆菌处理小鼠肺中分离细胞，用以研究热休克诱发γ－δT淋巴细胞增殖的能力。这些器官中的γ－δT淋巴细胞对热休克刺激（42℃，30 min）的增殖反应良好，表明γ－δT淋巴细胞对其自身热休克蛋白具有反应性。
Born等在一系列实验中证实γ－δT淋巴细胞可对应激蛋白发生反应。多数能对PPD发生反应的γ－δT淋巴细胞杂交瘤，在分枝杆菌HSP的作用下都可产生IL－2。这些杂交瘤细胞也可自发地产生IL－2，提示它们对其自身的蛋白质也有反应性。表位作图分析显示此种反应性系针对分枝杆菌，且与自身性同源物，小鼠分子量63×103蛋白发生微弱反应。Hsp－60的多肽可在体内诱发γ－δT淋巴细胞的克隆增殖。
利用少数人类γ－δT淋巴细胞所进行的研究证实，这类细胞可对分枝杆菌65×103应激蛋白发生反应。能与分枝杆菌发生反应的γ－δT淋巴细胞亚群与能识别Daudi淋巴瘤细胞株者相似，而且这种反应性可被抗人分子量60×103 Hsp抗体所阻抑。Kaur等用一单克隆抗体在Daudi细胞表面证实了Hsp－60的存在。人类γ－δT淋巴细胞识别热休克蛋白克隆的进一步事实为T淋巴细胞克隆在人分子量65×103 HSP的作用下可以发生增殖反应。
另外还有一些研究结果表明分枝杆菌的分子量65×103蛋白并非诱发γ－δT淋巴细胞发生反应的主要抗原。例如，麻风病变中的γ－δT淋巴细胞就对分子量65×103蛋白的刺激不发生增殖反应。此外，感染BCG小鼠的γ－δT淋巴细胞也不对HSP－65蛋白发生反应。Kabelitz等人的研究也证实分枝杆菌分子量65×103蛋白不是人类中主要的γ－δT淋巴细胞抗原。他们应用有限稀释分析法测定正常供血者外周血中抗原反应性γ－δT淋巴细胞前体细胞的频率。结果发现，1/2～1/20的CD4－CD8－T淋巴细胞可以与分枝杆菌发生反应，但只有1/200～1/2 000的细胞与分子量为65×103的蛋白发生反应。这些结果明确地表明分子量65×103蛋白并非正常人外周血中γ－δT淋巴细胞的主要抗原。
总之，目前尚不能肯定分子量65×103热休克蛋白及其同源物作为激活人类γ－δT淋巴细胞抗原靶分子以诱发抗分枝杆菌免疫应答的重要性。小鼠和人类γ－δT淋巴细胞反应性中的差异可能反映了实验系统的不同或抗原识别方式的固有差别。
（二）其他γ－δT淋巴细胞抗原
Pfeiffer提出，有两种人类γ－δT淋巴细胞抗原：一种大小约为分子量30×103的抗原可为γ－δT淋巴细胞和α－βT淋巴细胞所识别；另一分子大小约为分子量2×103的抗原则仅为γ－δT淋巴识别。后者的反应性并不被蛋白酶的处理而发生降解，且可结合至外源性凝集素，提示人类γ－δT淋巴细胞可以和糖类或糖脂相结合。对脐血中γ－δT淋巴细胞的研究表明了结核分枝杆菌类脂组分的反应性。
Boom等也研究了健康者外周血对分枝杆菌的反应，发现对分枝杆菌培养滤液中分子量65×103或71×103蛋白，或对诱发热休克蛋白的抗原呈递细胞经IFNγ处理后的γ－δ反应性都很低。而用活的或死的分枝杆菌攻击的小鼠体内则有较强的γ－δT淋巴细胞应答，提示这是针对细菌性抗原或者是活的细菌优先表达的超抗原。此外，γ－δT淋巴细胞尚可对在人类巨噬细胞上所诱导的热休克蛋白发生反应。小鼠和人类γ－δT淋巴细胞对已知热休克蛋白反应性的差异也反映不同实验系统和抗原识别方式的不同。
对于γ－δT淋巴细胞非肽配体的了解上已有了若干突破。已证实合成性烷基磷酸盐、乙基磷酸盐能模拟分枝杆菌在刺激γ－δT淋巴细胞增殖方面的生物学活性。以后又证实，核苷三磷酸是刺激这类T淋巴细胞亚群的天然分子。Tanaka等并证实异戊烯焦磷酸（isopentenyl prophosphate）以及相关的苯基焦磷酸盐均为刺激γ－δT淋巴细胞的天然分子。γ－δT淋巴细胞识别这些化合物的能力可以决定其对微生物病原体的广泛反应性。
（三）γ－δT淋巴细胞受体
γ－δT淋巴细胞识别抗原的本质尚可间接地从对TCR群体进行的分析中而得知。如果抗原反应性γ－δT淋巴细胞群体能够利用许多可变区（V）基因片段，并且具有多种方式的V－J连接，则很有可能有大量的抗原被识别。相反，如果只有少量V区被发现，而且V－J连接方式不多，则表示只有少量的抗原被识别。
Happ等在分析对分子量65×103蛋白发生反应的γ－δT淋巴杂交瘤细胞TCR群体时发现，所有的这类细胞利用Vγ1基因片段和极高百分率的Vδ6基因片段，由于V－J连接方式多样，所以可能有两种解释。第1种认为V区可以与某些不变式主要组织相容性复合体（invariant MHC）分子相互作用，并能提供抗原识别中细微特异性的连接作用。与这一解释不一致者为这些杂交瘤细胞都可识别同一种抗原肽。第2种可能性则是如同超抗原所特有的那样，抗原直接为V基因编码的区域所识别。但是这些杂交瘤一般识别小型的抗原肽，而超抗原则识别大型未经处理的蛋白质。另外，超抗原需要有MHC－Ⅱ类分子进行抗原呈递，而这些杂交瘤反应并不依赖与MHC－Ⅱ类分子之间的相互作用。
研究者对于人类γ－δT淋巴细胞对结核分枝杆菌反应的基因多样性曾经进行了广泛的研究，研究结果表明，结核分枝杆菌和Daudi细胞株的反应性都需要有Vγ2和Vδ2基因编码片段的存在。出生后外周血中Vγ2－Vδ2T淋巴细胞的增殖可能与环境中微生物，如非结核性分枝杆菌的刺激有关。
γ和δ链V－J连接方式的分析表明，在N，Dδ和Jδ基因片段之间都可表现有基因多样性。但对JγP基因片段而言，则尚有一些选择作用。这些发现表明这些反应与超抗原反应相似。或者是通过与一些不定式MHC分子和TCR V区的结合而识别多种抗原。
麻风病变中γ－δT淋巴细胞的分析表明这类细胞对少数抗原的克隆选择。免疫组织化学染色法研究显示，病变中带有Vδ1和Vδ2的细胞数目大致相等，而在同一个体的血液中则是带有Vδ2者占优势。在表皮中则只发现有带Vδ1的细胞，表明这是在表皮中的特异性定居，或是能与表皮环境发生作用。V－J重排的聚合酶链反应（PCR）扩增的研究显示了Vδ1基因片段与Vδ1和Vδ2基因片段选择性利用。这些病变γ－δT淋巴细胞V－J连接的核苷酸多样性极为有限，而且在活组织检验标本中在部位上各不相同。不过在病变中和不同个体之间则有氨基酸序列上的保守性。虽然Vδ1和Vδ2 TCR都是经过克隆选择的，但Vδ1细胞在体内是高度活化的，因为这一T淋巴细胞亚群在体外与IL－2共同培养时发生选择性的增殖。
因为在局部美洲皮肤利什曼病的病变中可以发现有γ－δT淋巴细胞聚集，这种疾病病变中的TCR－γ－δT淋巴细胞与在麻风中发现者的平行比较研究显示了两者之间的明显相似性，包括：①Vδ1在覆盖皮肤浸润物表皮中的定位；②与同一病人血液中γ－δ细胞相比较的有限的Vδ基因重排和V－J连接；③克隆性上的区域内和区域间的差异；④Vδ2－N－Dδ3－N－Jδ1重排的明显倾向性和很少发现有多种Dδ基因片段；⑤病变中Vδ2细胞V－J连接上L/V－G－G/D基因序列的突出表现。关于何故截然不同的两类微生物，如麻风分枝杆菌和巴西利什曼原虫之间能表现TCR分子水平上的相似性，可能有3种不同的解释：①两类不同病原体所共有相同抗原或同源物的识别；②表达于皮肤上的自身抗原的识别；③组织特异性抗原呈递分子的识别。
四、展望
通过上述的一些观察，再加上已知有关γ－δT淋巴细胞的免疫生物学知识，可以得知这一T淋巴细胞亚群可能在抗感染的早期防御机制中起作用：第一，γ－δT淋巴细胞位于与外界接触的器官之内，如皮肤、肠道和肺脏；第二，人类胸腺内配备有能与细菌发生作用的γ－δT淋巴细胞，而且γ－δ细胞群体能与很多病原体发生反应，这些细胞都具有很快地与以往从未接触过的感染因子发生反应的能力；第三，在人类和小鼠中都已证实，在感染的早期有γ－δT淋巴细胞的聚集。
确定γ－δT淋巴细胞在抗感染中的作用是否与识别α－βT淋巴细胞所不能识别的抗原有关，或系具有与α－βT淋巴细胞所不同的免疫功能至关重要。γ－δT淋巴细胞的可能作用包括刺激肉芽肿的形成或感染靶细胞的裂解，或两者均有。相反，识别靶分子和自身抗原的能力亦可引起免疫病理反应，如结核病中的乳酪样坏死病变、麻风中的神经损伤和利什曼原虫感染中的皮肤溃疡。对γ－δT淋巴细胞的特异性和功能的进一步研究将有助于了解分枝杆菌感染时γ－δT淋巴细胞的免疫调节作用。
（余传霖）
1.Modin RL，Barnes PF.Gamma－Delta T cells and mycobacteria.Rom WN，Gray SM，eds.In：Tuberculosis.Little：Brown Co，1996，329～334
2.Janis E M，Kaufmann SH E，Schwartz R H，et al.Activation ofγ－δT cells in the primary immune response to Mycobacterium tuberculosis.Science，1989，244：713～716
3.O’Brien R L，Happ M P，Dallas A，et al.Stimulation of a major subset lymphocytes expressing T cell receptorγ－δby an antigen derived from Mycobacterium tuberculosis.Cell，1989，57：667～674
4.Augustin A，Kubo RT，Sun GK.Resident pulmonary lymphocytes expressing theγ－δT cell receptor.Nature，1989，340：239～241
5.Holohitz J，Koning RT，Kolingen JE，et al.Isolation of the CD4－CD8－mycobacteria－reactive T lymphocyte clones from rheumatoid arthritis synovial fluid.Nature，1989，339：226～229
6.Modin RL，Pirmez C，Hofman FM，et al.Lymphocytes bearing antigen－specificγ－δT cell receptors in human infectious disease lesions.Nature，1989，339：544～548
7.Haregewoin A，Soman G，Hom RC，et al.Humanγ－δ＋T cells respond to mycobacterial heat shock protein.Nature，1989，340：309～312
8.Kabelitz D，Bender A，Schondelnaier S，et al.A large fraction of human peripheral bloodγ－δT cells is activated by Mycobacterium tuberculosis but not by its 65－kDa heat shock protein.J Exp Med，1990，171：669～679
9.Tsuyuguchi I，Kawasumi H，Ueta C，et al.Increase of T－cell receptorγ－δbearing T cells in cord blood of new－born babies obtained by in vitro stimulation with mycobacterial cord factor.Infect Immun，1991，59：3 053～3 059
10.Fujita M，Miyachi Y，Nakata K，et al.γ－δT cell receptor－positive cells in human skin I.Incidence and V－region gene expression in granulomatous skin lesions.J Am Acad Dermatol，1993，28：46～50
11.Ito M，Kojiro N，Ikeda T，et al.Increased proportion of peripheral bloodγ－δT cells in patients with pulmonary tuberculosis.Chest，1992，102：195～197
12.Tazi A，BouchonnetF，Valevre D，et al.Characterization ofγ－δT lymphocytes in the peripheral blood of patients with active tuberculosis.Am Rev Respr Dis，1992，146：1 216～1 221
13.Barnes PF，Grisso CL，Abrams JS，et al.γ－δT lymphocytes in human tuberculosis.J Infect Dis，1992，165：506～512
14.Barnes PF，Abrams JS，Lu SZ，et al.Patterns of cytokine production by mycobacterium－reactive human T cell clones.Infect Immun，1992，61：197～203
15.Rajasekar R，Sim GK，Augustin A.Self heat shock andγ－δT cell reactivity.Proc Natl Acad Sci USA，1990，87：1 767～1 771
16.Born W，Hall L，Dallas A，et al.Recognition of a peptide antigen by heat shock－reactiveγ－δT lymphocytes.Science，1990，249：62～69
17.Fu YX，Cranfill R，Vollmer M，et al.In vivo response of murineγ－δT cells to a heat shock protein－derived peptide.Proc Natl Acad Sci USA，1993，90：322～326
18.Kaur I，Voss SD，Gupta RS，et al.Human peripheralγ－δT cells recognize HSP60－molecules on Daudi Burkitt’s lymphoma cells.J Immunol，1993，150：2 046～2 055
19.Haregewoin A，Singh B，Gupta RS，et al.A mycobacterial heat shock protein－responsiveγ－δT cell clone also responds to the homologous human heat shock protein：apossible link between infection and autoimmunity.J Infect Dis，1991，163：156～160
20.Boom WH，Chervenak KA，Mineck MA，et al.Role of the mononuclear phagocyte as an antigen presenting cell for humanγ－δT cells activated by live mycobacterium tuberculosis.Infect Immun，1992，60：3 480～3 488
21.Constant P，Davodeau F，Peyrat M，et al.Stimulation of human gamma－delton T cells by non－peptide mycobacterial ligands.Science，1994，264：267～270
22.Tanaka Y，Sano S，Nieves E，et al.Non－peptide ligands for human gamma－delta T cells.Proc Natl Acad Sci USA，1994，91：8 175～8 179
23.Tanaka Y，Morita CT，Nieves E，et al.Natural and synthetic non－peptide antigens recognized by human gamma－delta T cells.Nature，1995，375：155～158
24.Happ MP，Kubo RT，Palmer E，et al.Limited receptor reportorie in a mycobacteria－reactive subset ofγ－δ
T lymphocytes.Nature，1989，342：696～698
25.Kabelitz D，Bender A，Prospero T，et al.The primary response of humanγ－δ＋T cells to Mycobacteria tuberculosis is restricted to Vγ9－bearing cells.J Exp Med，1991，173：1 331～1 338
26.Ohmen JD，Barnes PF，Uyemura K，et al.The T cell receptors of humanγ－δT cells reactive to Mycobacterium tuberculosis are encoded by specific V genes but diverse V－J junctions.J Immunol，1991，147：3 353～3 359
27.Davodeau F，Peyrat M A，Hallet M M，et al.Close correlation between Daudi and mycobacterial antigen recognition by humanγ－δT cells and expression of V9JPC1γ/V2DJCδ－encoded T cell receptors.J Immunol，1993，151：1 214～1 223
28.Uyemura K，Deans RJ，Hand H，et al.Evidence foe clonal selection ofγ－δT cells in response to a human pathogen.J Exp Med，1991，174：683～692
29.Uyemura K，Ho CT，Ohmen JD，et al.Selective expansion of Vγ1＋T cells from leprosy skin lesions.J Invest Dermatol，1992，99：848～852
30.Uyemura K，Klotz J，Pirmez C，et al.Microanatomic clonality ofγ－δT cells in human leishmaniasis lesions.J Immunol，1992，148：1 205～1 211
31.Soderstrom K，Halapi E，Nilson E，et al.Stnivial cells responding to a 65－k Da Mycobacterial heat shock protein have a high proportion of a TCRγ－δsubtype un－common in peripheral blood.Scand J Immunol，1990，32：503～515
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