单核—巨噬细胞检查

第三节　单核—巨噬细胞检查

一、形态学检查

（详见本章第一节）

二、组织化学染色检查

（一）氧化物酶染色（POX染色）

原理　粒细胞和单核细胞的胞浆中含有髓过氧化物酶（myeloperoxidase，POX 或MPO）。能将底物过氧化氢分解，产生新生态氧，它能够将四甲基联苯胺氧化为联苯胺蓝。联苯胺蓝自我脱氢氧化，则显棕色四甲基苯醌二胺。若加入亚硝基铁氰化钠与联苯胺蓝结合，可形成稳定的蓝色颗粒，定位于细胞浆酶所在的部位。

结果　在观察要辨认的细胞POX染色结果前，首先要注意观察成熟粒细胞是否呈强阳性，以判断染色是否成功。在细胞浆中，出现蓝色或蓝黑色颗粒为阳性反应。阳性强度判断：阴性：无颗粒；弱阳性：颗粒小，分布稀疏；阳性：颗粒稍粗，分布较密集；强阳性，颗粒粗大，密布于整个胞浆。

单核细胞系　除早期原始阶段外，皆呈弱阳性反应，其颗粒细小稀疏，分布不匀。

临床应用

POX染色是临床上最常用的、最重要的辅助判断急性白血病细胞的化学染色方法；因为不同细胞类型的急性白血病，其结果常不同。

1.急性单核细胞白血病（简称急单）　原单、幼单细胞多数呈阴性或弱阳性。

2.急性粒单细胞白血病　原单、幼单细胞呈阴性或弱阳性，原粒细胞呈阳性或阴性。

3.淋巴瘤白血病和恶性组织细胞病呈阴性。

临床上怀疑急性白血病，首选POX染色，以区分是急性髓细胞白血病还是急性淋巴细胞白血病，否则易做出错误的判断。如变异型的急性早幼粒细胞白血病极易误诊为急单、急粒中如以小型原粒细胞为主者极易误认为急淋等。POX阳性既是急性髓细胞白血病（阳性较强常见于急性粒细胞白血病，弱阳性常见于急性单核细胞白血病）；阴性说明各种急性白血病的可能性均有，需进一步选择其他实验明确诊断。

（二）苏丹黑B染色

原理　苏丹黑B（sudan black B， SB）是一种能溶解于脂肪中的色素染料，可使细胞内的中性脂肪、磷脂和类固醇着色，即使胞内微细结构的脂类物质也能显示出来。

结果　苏丹黑B阳性颗粒呈棕黑色，定位于胞浆中。

（1）单核细胞系阳性颗粒细小，分布弥散，形状不规则。原单核细胞为阴性。

（2）尼曼－匹克细胞和戈谢细胞均为阳性反应。

临床应用

苏丹黑B和过氧化物酶染色临床意义相似，主要用于急性白血病类型的鉴别。过氧化物酶染色要求涂片新鲜，立即固定，才能保持酶活性，得出正确结果；而苏丹黑B染色则无此要求。

（三）酯酶染色

酯酶是分解各种酯类的水解酶，根据机制的不同，分为非特异性酯酶和特异性酯酶，非特异性酯酶又称单核细胞酯酶，特异性酯酶又称粒细胞酯酶，因此在判别单核细胞类或中性粒细胞类时非常有用，特别是二重染色法非常重要。

酯酶染色的方法较多，常根据其作用液的pH和底物的不同将常用的酯酶染色法分为两类：①特异性酯酶（specific　esterase SE）染色法，如氯醋酸 AS-D萘酚酯酶（naphthol AS-D chloroacetate esterase）染色法；②非特异性酯酶（nonspecific esterase，NSE）染色法，常用a-醋酸萘酚酯酶和a-丁酸萘酚酯酶染色法。

1.醋酸AS-D萘酚酯酶染色（粒细胞酯酶、特异性酯酶）

原理　血细胞内的氯醋酸 AS-D 萘酚酯酶（naphythol AS-D chloroacetate esterase，NAS-DCE）水解基质液中的氯醋酸 AS-D 萘酚，产生 AS-D 萘酚，进而与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。本试验常用的重氮盐为坚牢紫酱 GBC，形成的有色沉淀为红色。NAS-DCE 几乎仅出现在粒细胞、其特异性高，因此又称为“粒细胞酯酶”、“特异性酯酶”。

结果　单核细胞系统　绝大多数为阴性反应，但有个别单核细胞系统的细胞也呈弱阳性反应。

临床应用　主要用于辅助鉴别急性白血病细胞类型。

（1）急性粒细胞白血病时呈阳性反应。

（2）急性单核细胞白血病　原单及幼单细胞几乎均呈阴性，个别细胞弱阳性。

（3）急性粒－单细胞白血病　部分白血病细胞原粒及早幼粒细胞呈阳性反应，

（4）急性淋巴细胞白血病时呈阴性反应。

2.α－醋酸萘酚酯酶染色

原理　血细胞内的α- 醋酸萘酚酯酶（α-naphythyol acetate esteraseα-NAE）在 pH中性的条件下水解基质液中的α- 醋酸萘酚，释放出α- 萘酚，进而与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。本试验常用的重氮盐为坚牢蓝B，形成的有色沉淀为棕黑色或灰黑色，α-NAE存在于单核细胞、粒细胞和淋巴细胞中，故它是一种中性非特异性的酯酶。单核系细胞的阳性可被氟化钠抑制，所以做α-NAE染色时，通常同时做氟化钠抑制试验。

临床应用　主要用于辅助鉴别急性白血病细胞类型。

（1）急性单核细胞白血病：单核细胞大多数呈阳性，氟化钠抑制率＞50%。

（2）急性粒细胞白血病：原粒细胞呈阴性或弱阳性，弱阳性反应不被氟化钠抑制。

3.酸性α-醋酸萘酚酯酶染色（ANAE）

原理　血细胞中的酸性α-醋酸萘酚酯酶（acid　α- naphythyol acetate esterase，ANAE）在pH弱酸性（pH5.8）的条件下，水解基质液中的α-醋酸萘酚，产生α-萘酚，萘酚在与六偶氮付品红形成红色沉淀，定位于胞质中酶活性处。

临床应用

（1）初步鉴别 T、B 淋巴细胞：成熟 T淋巴细胞呈点状颗粒或块状阳性，B淋巴细胞大多呈阴性反应，偶见稀疏、弥散的细小颗粒。

（2）有助于鉴别急性白血病类型：急性T淋巴细胞白血病常呈点状或块状阳性，急性粒细胞白血病常呈阴性或弱阳性，急性颗粒异常增多的早幼粒细胞白血病呈阳性较强（呈弥散分布），急性单核细胞白血病呈强阳性（呈弥散分布）。

ANAE染色临床上主要用于鉴别T、B淋巴细胞，而目前淋巴细胞白血病的分类常用荧光染色用流式细胞仪分类，该方法更准确。所以ANAE染色应用较少。

4.酯酶双染色　在同一张涂片上进行两种酯酶染色的方法称为酯酶双染色。多数采用一种特异性酯酶加一种非特异性酯酶染色，故常用的有α-醋酸萘酚酯酶与氯醋酸AS-D萘酚酯酶双染色、α-丁酸萘酚酯酶与氯醋酸AS-D萘酚酯酶双染色等。反应的原理基本上同各自的染色原理，但同一张涂片上的血细胞要分别在两种不同的基质液中作用一定时间，最后复染、显微镜观察。酯酶双染色对诊断急性粒-单细胞白血病的诊断具有独特的价值，既在同一张片中出现两种酯酶染色阳性的细胞或同一种细胞同时出现两种酯酶染色阳性结果。

三、墨汁吞噬试验

原理　血液中中性粒细胞及单核细胞对细菌、异物等具有吞噬作用。在一定量的肝素抗凝血中，加入一定量的墨汁，经37℃温育4小时，涂片染色镜下观察吞噬细胞对墨汁的吞噬情况，并计算吞噬率及吞噬指数，可提供临床对疾病如急性白血病类型的鉴别参考。

参考值　成熟中性粒细胞吞噬率74%±15%，吞噬指数126±60；成熟单核细胞吞噬率95%±5%，吞噬指数313±86。

临床应用

粒细胞的吞噬功能仅限于成熟阶段，单核细胞幼稚型和成熟型都具有吞噬能力。急性单核细胞白血病M5a为弱阳性，M5b吞噬指数明显增高。急中性粒细胞性粒细胞（M2）、急性淋巴细胞和急性早幼粒细胞白血病的原始及有着细胞多无吞能力，吞噬试验为阴性。急性粒-单核细胞白血病呈阳性反应，对鉴别有一定价值。慢性粒细胞白血病的成熟中性粒细胞吞噬能力明显减低。

四、血清溶菌酶活性试验

溶菌酶存在于粒细胞和单核细胞，溶菌酶活性随细胞成熟而增加。血浆和尿中的溶菌酶大多来自白细胞的分解，可作为白细胞更新的特征。

原理　溶菌酶能水解革兰氏阳性球菌的细胞壁乙酰氨基多糖成分，使细胞失去细胞壁而破裂。以对溶菌酶较敏感的微球菌悬液为作用底物，根据微球菌的溶解程度来检测血清或尿中溶菌酶的活性。现以比浊法介绍如下。

参考值　血清5～15mg/L ；

尿0～2mg/L。

临床应用

在人体血清中的溶菌酶，主要来自血中的单核细胞和粒细胞，其中以单核细胞含量最多。在中性粒细胞中，从中幼粒到成熟粒细胞可随细胞的成熟程度而增高。嗜酸性粒细胞，除中幼阶段外，均无此酶活性。淋巴细胞中则含量极低。血清和血浆中的溶菌酶大部分是由破碎的白细胞所释放。白血病患者血清溶菌酶含量的变化很大，与其细胞类型有密切关系。急性单核细胞白血病的血清溶菌酶含量明显增高，由于成熟单核细胞溶菌酶的含量很多，因而在周围血中成熟单核细胞的多少，直接影响血清溶菌酶的测定值。一般认为急单血清溶菌酶增高，是由于患者的单核细胞不能转移到组织内或溶菌酶迅速从单核细胞释放入血的结果。尿溶菌酶含量也增高，故尿溶菌酶阴性可排除急单的诊断。

急性粒－单核细胞白血病血清溶菌酶含量也有明显增高，其增高程度与白细胞总数有关。在治疗前其含量明显高，表示细胞分化程度较好，预后亦较好。 急性粒细胞白血病的血清溶菌酶的含量可正常或增高，临床意义与急粒-单核细胞白血病相似。急性粒细胞白血病和急性单核细胞白血病都是在治疗缓解，白细胞减少时，其含量也同时下降，但在复发时上升。 急性淋巴细胞白血病多数减低，少数正常。慢性粒细胞白血病血清溶菌酶含量正常，但急变时下降。

五、吞噬细胞吞噬功能试验

原理　活体巨噬细胞、单核细胞在体内外均有吞噬细菌、异物的功能，在体外将细胞与异体细胞或细菌混合孵育后，染色观测其吞噬异体细胞或细菌的数量，可了解其吞噬功能。利用中药斑蝥在人的前臂皮肤上发疱，造成非感染性炎症，诱使单核细胞游出血管大量聚集于疱液内，抽取疱液则成为天然提纯的吞噬细胞悬液。以鸡红细胞为靶细胞，在体外 37℃条件下观察吞噬细胞对鸡红细胞的吞噬消化活性，取试管内的细胞进行涂片染色和镜检并计算吞噬百分率和吞噬指数。

参考值　吞噬百分率（62.77±1.38）% ；

　　　　吞噬指数1.058±0.049。

临床应用

吞噬细胞是机体单核吞噬系统的重要组成部分，而单核吞噬系统与肿瘤的发生发展有密切关系，吞噬细胞在组织中含量多，分布广，移动力强且能识别肿瘤细胞，所以吞噬细胞在机体免疫监视系统中发挥主要作用。吞噬细胞功能检测基础理论研究和临床治疗都有重要意义。此法可测定吞噬细胞的非特异性吞噬功能。

1.巨噬细胞吞噬功能低下主要见于各种恶性肿瘤，吞噬率常低于45%，手术切除好转后可以上升，故可作为肿瘤病人化疗、放疗、免疫治疗疗效的参考指标。

2.一些免疫功能低下的病人，吞噬率降低，可作为预测感染发生的概率，并观测疗效、判断预后的指标。

六、单核细胞总数的测定

1.标记单核细胞半衰期（T1/2）：4.5～10.0h

2.全血单核细胞池（total blood monocyte pool TBMP）TBMP：（3.9～12.7）×10⁷/kg

3.循环单核细胞池（circulation monocyte pool CMP）CMP：（1.0～2.7）×10⁷/kg

4.边缘单核细胞池（marginal monocyte pool MMP）CMP：（2.4～11.7）×10^7/kg

5.单核细胞周转率（monocyte turnover rate MTR）CMP：（7.2～33.6）×10^7//kg

临床应用

在慢性白血病、真性红细胞增多症和骨髓纤维化时，TBGP 及 GTR显著增加。粒细胞半寿期明显延长。急性粒细胞白血病时有轻微的延长，而再生障碍性贫血时各指数测定值均偏低。

七、免疫学检查方法

单核－巨噬细胞分泌的白细胞介素、细胞因子、单核－巨噬细胞受体及表面标志可以采用以下方法检验。

（一）荧光显微镜计数检测

原理 将抗体标记上荧光素制成的荧光抗体，在一定条件下与细胞表面的分化抗原簇相互作用，洗去游离的荧光抗体后，结合于细胞表面的荧光素在一定波长激发光照射下，发出一定波长的荧光，借此用荧光显微镜就可检测到与荧光抗体特异结合的表面标志。以鼠抗羊IgG作阴性对照，标本中有明显荧光现象就证明有相应的抗原存在，借此对标本中的抗原作鉴定和定位。根据标记物和反应程序的不同分为：直接荧光法，即将荧光素直接标记在特异性抗体上，直接与相应抗原起反应，根据荧光有无来检测抗原。间接荧光法：将荧光素标记抗体，待基质标本中的抗原与相应抗体（一抗）反应，再用荧光标记抗抗体（二抗）结合第一抗体，呈现荧光现象。另外还有双标记法和三标记法，即用两种荧光素分别标记不同抗体，对同一基质标本进行染色，可使两种抗原分别显示不同颜色的荧光。主要用于同时观察细胞表面两种抗原的分布与消长关系。常用异硫氰酸荧光素（FITC）和藻红蛋白（PE）作双重标记染色，前者发绿色荧光，后者发橙红色荧光，别藻青蛋白（APC）发红色荧光。

结果　观察标本的特异性荧光强度一般用+号表示，-表示无荧光；±为极弱的可疑荧光；+为荧光较弱但清楚可见；2+为荧光明亮；3+～4+为荧光闪亮。

计算公式：

阳性细胞率=荧光阳性细胞/（荧光阳性细胞+荧光阴性细胞）×100%细胞膜上结合的因子或细胞内源性因子可用特异性抗体作间接免疫荧光测定。待测定的细胞可以是悬浮的活细胞，也可以是固定细胞或组织切片。

（二）流式细胞仪计数检测

原理　流式细胞仪（flow cytometer，FCM）是对单细胞快速定量分析和分选的新技术。当被测细胞被制成单细胞悬液，经特异性荧光染料染色后加入样品管中，在气体压力推动下，流经 100μm的孔道时，细胞排成单列，使荧光标记的细胞一个个地通过仪器的毛细管，分别辨认细胞形态大小和荧光特征，称为荧光活化细胞分选法（flow Cytomatric cell sorting，FACS）。细胞逐个匀速通过激光束，被荧光染料染色的细胞受到强烈的激光照射后发出荧光，同时产生散射光。荧光被转化为电子信息，在多道脉冲高度分析仪的荧光屏上，以一维组方图或二维点阵图及数据表或三维图形显示，计算机快速而准确地将所测数据计算出来，结合多参数分析，从而实现了细胞的定量分析。

流式细胞仪可看作荧光显微镜的延伸，与荧光显微镜相比，其优势是短期可分析数万个细胞，还可用计算机记录处理，快速地对各个细胞进行多参数定量分析。多色荧光分析还可识别一个细胞上同时存在的数种荧光的颜色。

结果　流式细胞术的数据显示以直方图（histogram）形式表示。

数据分析　流式细胞术分析免疫荧光样品主要获取两项参数：免疫荧光阳性细胞百分比和荧光强度。免疫荧光多采用非参数方法，计算各部分细胞百分比，只要计算3个峰下面的面积即可。在峰间“谷”的最低处画一条垂直于横坐标的直线，3个峰以直线为界，逐个计算峰下的细胞数并与总细胞数相比。即可得出3种细胞在整个群体中所占的百分比。并计算免疫荧光阳性细胞百分比和荧光强度。

用以上两种方法，可以检测单核细胞上的抗原和单核-巨噬细胞表面受体。基本只表达在单核细胞上的抗原有：CD16、CD64、CD68、CD91、CDw136 和CD65。CD68是目前发现可靠的检测造血系统内单核-巨噬细胞系统的特异标志，用CD68单抗可将AML-M1～M3与AML-M4及AML-M5区别开来。 单核-巨噬细胞表面受体　单核-巨噬细胞大约表达十多类受体，研究得最多的是介导细胞内噬的受体，如Fc受体 ；另一类重要的受体是补体受体，如C3b 的受体CR1是一个糖蛋白，表达在单核细胞，巨噬细胞，红细胞和中性粒细胞上。CR1 在免疫反应中，包括免疫复合物的清除和加工处理中起重要作用，同时也在补体C3b 调理的微生物的粘附上起重要的作用。巨噬细胞还表达许多多肽生长因子的受体，这些受体的配体分别为 IL-1、IL-2，IL-4，IL-6，IL-13，CSFs，INF－γ以及血小板激活因子（PAF）。

（三）碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶桥联酶标法检测（APAAP）

原理 碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶桥联酶标术（alkaline phosphase　antialkaline phosphatase，APAAP）法，是用碱性磷酸酶作为标记物标记已知抗体或抗抗体，进行抗体、抗原反应。先用鼠单抗制备一种碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶单克隆抗体（APAAP）复合物，然后按照细胞抗原成分与第1抗体（鼠抗人单抗）、第2抗体（兔抗鼠抗体）、APAAP复合物依次结合后，通过碱性磷酸酶水解外来底物显色，达到抗原定位。

结果　高倍镜下计数200个有核细胞，其中细胞膜上或细胞浆内有红色标记物着染的细胞为阳性，无红色标记为阴性细胞，计算出各片阳性细胞百分率，该百分率即分别代表个单抗所针对抗原的阳性百分率。阳性细胞等于或大于20%为阳性结果。

（四）生物素-亲和素酶标法检测

原理　生物素-亲和素酶标（avitin-biotinperoxidase complex，ABC）法是依据亲和素（avitin）和生物素（biotin）二者间有很强亲和力，生物素可以和抗体相结合，且结合后仍保持与亲和素连接的强大能力。辣根过氧化物酶不是标记在抗体上，而是标记在亲和素与生物素复合物上形成亲和素-生物素-过氧化物酶复合物即ABC。细胞抗原成分与特异性抗体称第1抗体结合后，与已标记上生物素的第2抗体起反应，再与ABC结合。ABC上辣根过氧化物酶作用于显色剂，使其产生有色沉淀，指示抗原存在部位。

结果　同APAAP法。