第三节淋巴细胞的发育与成熟

第三节　B淋巴细胞的发育与成熟 (Development and Maturation of B Lymphocytes)

B淋巴细胞(B lymphocyte)即骨髓依赖性淋巴细胞，简称B细胞，首次被证明在鸟类淋巴样器官法氏囊(Fabricius bursa)内发育成熟。目前认为鸟类的法氏囊可能相当于人胚胎期的肝和骨髓。B细胞来源于哺乳动物胎肝和成年骨髓中的淋巴样干细胞，在骨髓造血微环境参与下，发育成熟后定居于外周淋巴器官和组织中。在外周血中，B细胞约占淋巴细胞总数的10%～15%。

一、B细胞的成熟过程

B细胞分化成熟过程分为两个阶段，即抗原非依赖期和抗原依赖期(图9-4)。

图9-4　B细胞的发育分化过程

1.抗原非依赖期

抗原非依赖期在中枢免疫器官中进行，从多能HSC开始分化，经历祖B细胞、前B细胞、未成熟B细胞和成熟B细胞几个阶段，表现为功能性BCR的表达和自身耐受的形成。在此过程中，经历了膜表面分子的改变和免疫球蛋白的基因重排等。抗原非依赖期，B细胞分化无需抗原刺激，其经历如下阶段：

(1)祖B细胞(pro-B cell)阶段表型标志B220^lowCD43⁺。系发育早期的B细胞阶段，约在人胚胎第9周开始发生，小鼠约在胚胎第14天开始。该阶段先后发生Ig重链DJ基因重排和V-D-J基因，开始表达IgαI、Igβ分子，同时开始丢失CD43。

(2)前B细胞(pre-B cell)阶段由祖B细胞分化而来，约占骨髓有核细胞的5%。该阶段，前B细胞的Ig轻链V、J基因发生重排；可合成μ链出现于胞浆中；轻链(L)基因仍处于静止状态，无基因重排现象。无mIg表达，因此缺乏对抗原的反应能力，无免疫功能。开始表达CD19、CD20和MHCⅡ类分子。

(3)未成熟B细胞(immature B cell)开始丢失末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)和CD10分子，可表达完整mIgM，以及CD22、CD21、Fc受体。同时CD19、CD20、MHCⅡ类分子表达量增加。此阶段若接受抗原刺激，即发生克隆删除而导致免疫耐受。其主要决定因素是受体交联信号的强度：强信号诱导克隆清除；弱信号则出现克隆失能，这是B细胞自身耐受形成的主要机制之一。

(4)成熟B细胞(mature B cell)经上述分化发育过程形成成熟B细胞，其表型特征是同时表达mIgM和mIgD，也表达补体受体1(CR1)、Fc受体、某些丝裂原受体和细胞因子受体(CKR)，具备了对抗原的反应能力。成熟B细胞经血液迁移至外周淋巴器官和组织。未受抗原刺激的成熟B细胞亦称初始B细胞(naive B cell)。若无抗原刺激，初始B细胞在外周免疫器官中的寿命仅7～10天。一旦受抗原刺激，B细胞可被活化，发生增殖，分化，进入激活状态。此时，免疫球蛋白的基因转录加快，B细胞表面的BCR表达增加，向浆细胞分化。

2.抗原依赖期

此期通常发生在外周免疫器官，出现于B细胞对抗原产生应答后。定居于外周淋巴器官或组织的成熟B细胞接受外来抗原刺激后，在APC和Th细胞辅助下，进入活化、增殖状态，并发生广泛的Ig可变区体细胞超突变。一部分B细胞突变后不再与滤泡树突状细胞(FDC)表面的抗原结合，继而发生凋亡；另一部分B细胞经突变后，其BCR能更有效地与抗原结合，B细胞表面CD40表达增加，并与活化Th细胞表面CD40L结合，使该B细胞免于凋亡，在不同类别细胞因子的参与下，可发生Ig重链类别转换，从IgM转换为IgG、IgA、IgE的B细胞，进一步分化为产生分泌性抗体的浆细胞。少数分化为长寿记忆细胞，在无抗原刺激情况下，可存活数周至数月，并在血液、淋巴液和淋巴器官之间活跃地再循环，参与再次免疫应答。

二、B细胞抗原识别受体(BCR)发育

1.BCR基因

BCR是嵌入细胞膜脂质双层结构中的表面膜免疫球蛋白(mIg)。BCR即mIg，由BCR基因(Ig基因)编码。Ig的重链(H链)、κ链和λ链分别由三个独立的基因群编码，分别分布在不同的染色体上。每个Ig的胚系基因群至少由三个以上的基因片段组成，即V、C和J基因片段，此外，在Ig的重链基因群里尚有多样性基因(diversity gene，D基因)(表9-1)。这些胚系V区基因须经过基因重排才具有转录和表达功能。

表9-1　人免疫球蛋白基因定位

BCR(Ig)基因结构：编码H链的基因片段由可变区(variable region，VH)基因、多样性(diversity，DH)基因、连接(joining，JH)基因及恒定区(constant，CH)基因片段组成；编码L链可变区的为V基因片段(variable gene segment)、J基因片段(joining segment)；而编码重链可变区的为V、J基因片段和D(diversity)基因片段。V、D、J基因群各含多个片段，其中V基因片段数量最多。各类基因片段的相互分开(图9-5)。

图9-5　人Ig胚系基因组成示意图

(1)重链(H)基因库　人重链基因定位于第14号染色体长臂，由V、D、J和C四个基因片段和先导序列基因组成，共1250kb。上述各外显子间均存在无编码功能、长短不等的碱基序列插入。

先导序列基因(leader sequence，L)：为V区外显子的5'末端的核苷酸序列，编码20～30个N端残基。这些残基具有中度的疏水性，组成信号肽。新合成分泌的膜蛋白含有信号肽，其作用是引导在核糖体合成的多肽进入内质网腔中。然后，信号肽序列快速地分开，随即被内质网膜上的信号肽酶水解。

可变区(VH)基因片段：不同的动物种属中，V基因的数量也是不一样的。人H链基因库已鉴定出119个VH基因片段，每个基因片段之间相同的核苷酸序列数目达到70%～80%，其中具有开放读框(open reading frame，ORF)，能进行重排转录表达的功能性VH基因片段为38～45个，编码H链V区N端95个残基。

多样性基因(DH)片段：DH基因片段位于JH基因群5'端(VH和JH基因簇之间)，其序列和长度多变，由20多个DH基因片段组成。23个DH和6个JH基因片段编码H链V区C端的氨基酸残基。

连接(JH)基因片段：人有9个JH基因片段(其中6个为功能性)，位于DH下游，负责连接VH和CH基因片段，大约30～50bp。VH基因片段与DH、JH重组后，编码H链V区。

恒定区(CH)基因片段：CH基因片段连接V基因的3'末端，由9个CH成串排列。每个CH基因由5～6个外显子组成，其中3～4个外显子(每个外显子在大小上与V区的外显子相似)编码每条H链同种型的完整C区。两个较小的外显子编码C端，包括H链的跨膜区和胞浆区。

(2)轻链κ基因库　人L链κ定位于第2号染色体短臂，由约31～35个功能性的Vκ基因和5个Jκ基因组成；前者编码Vκ区N端的95个残基，后者编码Vκ的C端。无D基因片段。

(3)轻链λ基因库　人L链定位于第22号染色体长臂。由约29～33个功能性的Vκ基因(编码人Vλ区域N末端的95个残基)组成，另外尚有7个Jλ-Cλ基因组(Jλ1-Cλ1～Jλ7-Cλ7)，构成Jλ-Cλ位点，其中4个(1、2、3、7)有转录功能。如果λ基因重排顺利完成，则表达出相应的膜受体；如果λ重排无法进行，则由κ基因完成重排。

2.BCR(Ig)基因体细胞重排机制

发育中的淋巴细胞Ig胚系基因存在于机体的所有体细胞中，在DNA和早期RNA的转录中，C基因与V(D)J基因并未连接在一起，因此，胚系基因不能直接被转录为mRNA和抗原受体。须通过基因重排选择，最终由1个V基因、1个J基因、1个D基因，构成单个的V(D)J基因，再编码为BCR的可变区。

早期RNA的V(D)J基因最终和C基因连接起来，转录为mRNA，翻译为BCR的一条肽链。在基因的连接过程中，可能发生不准确连接，可延伸多达10个核苷酸。另外，不同的淋巴细胞克隆通过不同的V、D、J基因重排。此外，在V(D)J基因重排中，尚有核苷酸在连接部位的插入和缺失，如末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)在V-D和D-J连接中，催化DNA链3'端不依赖模板的随机的核苷酸的添加，参与N区(或称N核苷酸，为非生殖细胞系编码的核苷酸)形成，导致BCR的连接多样性(图9-6)。

Ig基因重排是一种特殊类型的DNA重排，通过发育中的淋巴细胞某些协同酶和某些广泛存在的DNA修复酶的协同活化而介导，这些酶被命名为V(D)J重组酶，识别的DNA序列称为重组信号序列(recombination signal sequences，RSS)。RSS定位于V基因的3'端，J基因的5'端，以及D基因的两侧(图9-7A)。

图9-6　BCR基因多样性

图9-7　V(D)J基因重组

RSS组成包括高度保守的七个核苷酸，又称为七聚体，定位于相邻的编码序列，然后是12个或23个非保守的核苷酸间隔顺序，接下来是高度保守的九个核苷酸，称为九聚体。这12个核苷酸或23个核苷酸间隔序列相当于一个DNA螺旋的1～2个拐角，并将牵引这七聚体和九聚体同时到达重组酶的位置。V(D)J重组酶引导DNA双链在RSS和邻近的V、D或J编码序列之间断裂，DNA双链断裂的方式有删除和倒置两种形式(图9-7B)：①删除，例如，在Ig轻链的V和J基因的重组，断裂将发生在V基因的3'端、J基因的5'端。临时的发夹环结构连接每个断端两侧DNA的平行链。这种阻碍性的双链DNA将通过“环”形式去除。接着两个DNA断端连接起来，并连接到V和J基因的编码序列。②倒置，大多数Ig基因重排通过删除进行，某些V基因，尤其是Ig的κ基因座，其V基因片段的5'端和J基因的3'端的识别序列可处于相同方向上。在Ig的κ基因座中，通过颠倒达到基因重排的约占50%。如果一个基因片段侧面具有12个核苷酸的间隔序列，另一个基因片段侧面具有23个核苷酸间隔序列，此时，在这两个基因之间将发生重组，这就是所谓的12/23法则。这些间隔序列和信号序列的定位保证了合适的基因片段重组，譬如，Ig重链基因座，在V和J基因片段之间具有23个核苷酸间隔序列，因此非直接连接。首先是D和J基因的重组，然后是V和DJ重组，可能因为D基因的两边侧链是12个核苷酸间隔序列，允许V-D和D-J连接。因此，只有V(D)J基因重组酶才能参与BCR的重组。

连接和分开DNA的RSS的V(D)J重组酶为RAG1-RAG2复合物。RAG1蛋白为一个双聚体，可以连接和分开DNA(一种特异性的核酸内切酶)，不过该蛋白酶活性的启动需要RAG1和RAG2复合到一起。V(D)J重组酶有一些重要特征：①RAG1和RAG2具备细胞特异性，只有在T、B淋巴细胞系才能产生；②RAG基因只有在未成熟的淋巴细胞才能表达，这可以解释为什么当功能性的抗原受体表达后，Ig基因在细胞内无法进行重组；③RAG基因主要在细胞周期的G₀和G₁阶段表达，而细胞增殖期无表达。

或许，在未成熟B细胞中，Ig基因接近重组酶尚有其他调节机制，包括染色体结构的改造、DNA甲基化等。

V-J或V-D-J重组的结果之一是位于V区域5'端的启动子，接近位于C基因3'端的增强子(图9-8)，通过增强子最大限度地激活了V基因启动子的转录活性，因而，增强子在淋巴细胞V基因高水平的转录中具有重要作用。

图9-8　Ig基因转录调节机制

3.BCR(Ig)多样性的机制

从胚系基因到体细胞突变，再到翻译剪接为成熟的BCR(Ig)，体现出庞大的多样性，其主要机制有如下几个方面：

(1)Ig胚系基因多样性即胚系Ig基因库中有数以百计的V基因，以及众多D的基因、J基因和C基因；

(2)Ig基因组合多样性即Ig基因产生于众多V、D、J、C基因片段的排列组合；

(3)连接点多样性即Ig基因在V-D-J重排过程中可出现不同连接点，且同一连接点可发生核苷酸删除(deletion)、插入(insertion)和倒置(inversion)；

(4)体细胞高频突变指发育后期和经抗原刺激后，滤泡生发中心内成熟B细胞已重排基因的若干核苷酸发生替换突变，在抗原和Th细胞存在下该突变频率明显增高。体细胞突变多发生在BCR的CDR，有助于抗原刺激后产生高亲和力抗体，合成高亲和力抗体的B细胞在免疫应答后期优势扩增，从而对抗原刺激产生更为迅速和强烈的应答。此过程称为抗体亲和力成熟，使B细胞对抗原刺激的应答由低下、迟缓(早期)转变为强烈、快速(晚期)。

据推算，V区基因组合数达3.4×10⁶，而连接多样性达3×10⁷，使BCR多样性高达10¹⁴。此外，H链和L链相互随机配对等机制也参与Ig多样性形成，由于上述诸多机制，机体针对千变万化的抗原刺激，赋予机体识别各种抗原，产生特异性抗体的巨大潜能。

综上所述，BCR种类繁多，其V区的CDR具有高度可变性，从而构成众多特异性BCR，能与相应抗原表位结合，此与BCR基因的结构特点、重排、突变有关。人B细胞BCR基因库包括重链及轻链基因库，均由数以百计的基因片段组成，且这些基因片段间均插入无编码功能、长短不等的碱基序列。B细胞系前体细胞在骨髓内发育时，重链基因经V-D-J重组，轻链基因经V-J重组，连接成编码V区的外显子，从而形成能表达BCR H链及L链的基因，并分化为成熟的B细胞，离开骨髓进入血流及次级淋巴器官。B细胞接受抗原刺激后，在次级淋巴组织生发中心内，其BCR基因经历受体突变及类别转换，继而B细胞分化为记忆B细胞及浆细胞，后者的BCR基因转录为mRNA，并在转录及翻译后水平进行加工，最终合成mIg。

与BCR(Ig)类似，TCR多样性的机制也涉及组合多样性、连接多样性。δ链可发生V-D和D-J基因重排，其D基因两侧N序列插入所造成的连接多样性高达10¹¹。此外，TCRβ、δ链可变区V-J基因重排以及α链和β链(或γ链和δ链)的随机组合，进一步增加TCR多样性。据推算，TCRα、β链和TCRγ、δ链V区基因组合数分别达5.8×10⁶和6×10²；连接多样性分别达2×10¹¹和1×10¹⁵；TCRα、β链和TCRγ、δ多样性总计分别达10¹⁸和10¹⁵。如此众多的TCR和BCR多样性，保证了T细胞和B细胞对抗原产生特异性免疫应答。