基因治疗的机制及临床应用范围

（一）肿瘤基因治疗的分类及机制

肿瘤基因治疗的基本原理是运用基因操作方法将外源遗传物质导入靶细胞以达到肿瘤治疗的目的，但不同类的方法达到肿瘤治疗目的的原理有很大的不同。基因操作在人体的应用根据其目的的不同可分为基因标记（geng marking）和基因治疗（geng therapy）两大类，前者的目的在于观察经遗传修饰后的靶细胞再体内分布，半衰期及临床应用的安全性等指标；而后者的应用则是为了达到肿瘤治疗的目的。故严格讲，基因示踪与基因治疗不同。而一般根据基因治疗临床疗效产生的不同原理，可将其分为类化学疗法、生物反应调整疗法和宿主保护疗法三大类（表6-3）。所谓类化学疗法是指此类技术的使用与常规肿瘤化疗在原理上有相似之处，两者均使用细胞毒因子直接杀伤或抑制肿瘤细胞，但本法使用的是基因工程药物或信息药物，故药物的特异性较高，不良反应也较小。目前临床用于治疗白血病及某些实体瘤的重组细胞因子、改形单克隆抗体（reshaped McAb）、融合毒素、反义核酸、特异性核酸酶和肿瘤抑制基因等均可归属此类。各种基因靶向表达系统如病毒导向的酶解药物前体疗法（virus directed enzyme prodrug therapy；VDEPT）、整合肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor；TNF）基因的肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte；TIL）等还能进一步提高类化学疗法的特异性和疗效。生物反应调整疗法主要通过调整、刺激或提高宿主全身或局部的抗肿瘤免疫力来间接杀灭肿瘤细胞，常用的方法是使用外源基因修饰肿瘤细胞或将肿瘤相关抗原基因与具有强免疫源性的外源基因偶联制备基因工程疫苗。近年来，随着对肿瘤免疫机制认识的深入，发现将HLAB7基因导入肿瘤细胞可为T细胞激活提供共刺激信号（costimulation signal），从而诱发强大的抗肿瘤免疫反应；靶向表达白介素2（interleukin-2，IL-2）和粒细胞、巨噬细胞克隆刺激因子（granulocyte macrophage-clonal stimulating factor；GM-CSF）不仅能有效促进瘤区肿瘤抗原递呈细胞和细胞毒T细胞的增殖，提高T细胞毒效应，还能促进瘤区其他炎症细胞如巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的浸润，从而更有效地杀伤肿瘤细胞。宿主保护疗法通常作为肿瘤放疗、化疗的辅助治疗手段，常通过保护宿主细胞或促进其增生来提高宿主对大剂量放化疗的耐受力。例如，将多向耐药基因（multiple drug resistance；MDR）或GM-CSF基因整合宿主骨髓干细胞，可使宿主机体耐受较大剂量的化疗而达到治疗肿瘤的目的。

表6-3　肿瘤基因治疗分类

（二）肿瘤基因治疗的临床和临床前研究

1．细胞因子基因治疗　1990年Rosenberg等首次报道使用整合携带NeoR基因标记的反转录病毒载体的TIL治疗5例晚期黑色素瘤，探索了人类肿瘤使用基因疗法的可能性，证实了经反转录病毒载体基因转移的TIL在临床应用的可行性与安全性。1991年2月他开始一项使用携带TNF基因的TIL治疗50例晚期黑色素瘤的临床研究。TNF在体外和小鼠肿瘤治疗中均显示强大的肿瘤细胞毒效应，但在用于临床肿瘤治疗时有效剂量的TNF毒性很大，安全剂量时肿瘤局部TNF浓度又太低，而使用TNF-TIL时瘤区TNF浓度则可望增加100倍。但初步的临床试验结果并不乐观，已报道使用该疗法的6例黑色素瘤病人中，仅使用TNF-TIL的3例病人未显示明显疗效，令3例病人再加用一定剂量的IL-2后也仅1例显示较明显的疗效。1991年10月，Rosenberg又进行了一项新的治疗尝试，取一晚期黑色素瘤病人的瘤结节，分离瘤细胞，在体外用TNF或IL-2基因修饰后接种于病人股部，3周后再取局部引流淋巴结分离淋巴细胞，体外用IL-2扩增后回输给病人，期望该疗法可增强TIL或细胞毒T细胞的肿瘤杀伤能力。但迄今为止，Rosenberg的TNF-TIL疗法并不成功，主要原因可能是TIL整合TNF基因后其肿瘤定位能力下降甚至消失，且TNF-TIL分泌的TNF量也达不到杀灭肿瘤细胞所需的浓度。目前，美国国立卫生院（NIH）的重组DNA顾问委员会（RAC）也对Rosenberg的TNF-TIL疗法提出了质疑，要求他证实该疗法的安全性和可行性，否则将拒绝为该项研究增加拨款。除Rosenberg的研究外，目前美国匹茨堡癌症研究所和法国里昂的Berard研究中心等多家单位也在进行类似的治疗尝试。

2．使用反义核酸的基因治疗　反义核酸可分为反义DNA和反义RNA两种，前者与靶细胞DNA双螺旋的特定部位形成三链构象而阻碍转录的进行，而后者可与靶细胞mRNA结合而阻止其翻译产生肿瘤蛋白。由于反义DNA需进入细胞核内方能发挥效应，而反义RNA的作用点在胞质中，故后者的应用在技术上较为简便。目前已进入临床试验阶段的反义寡核苷酸主要有两种：即针对P53mRNA的硫代磷酸寡核苷酸（PS Oligo）和用于治疗CML的甲基磷酸寡核苷酸（MP Oligo）。由于使用基因标记技术已证实，白血病或神经母细胞瘤等使用大剂量放化疗加自体骨髓移植治疗时，其复发主要原因之一是由于自体骨髓中所含的肿瘤细胞未能去除干净，而非由于肿瘤细胞耐药。故美国M．D．Anderson癌症中心设计了一项新的治疗方案：取CML病人骨髓，在体外用针对bcr-abl的反义RNA特异性地杀灭其中的白血病细胞以“净化骨髓”，同时给病人施行大剂量化疗和放疗以彻底杀灭体内的白血病细胞，再回输净化的自体骨髓。该方案的Ⅰ期临床试验预计治疗10例CML病人。另一项已被批准进行临床试验的方案为：使用携带Ki-ras反义基因、p53基因或IL-4基因的反转录病毒载体治疗非小细胞肺癌。

3．使用融合毒素的基因治疗　目前研制成功的融合毒素数量已不少，如IFN-γ／TNF-β、DAB389-EGF、DAB486-IL-2和DAB389-IL-2等，但目前仅DAB486-IL-2开始临床试验。DAB486-IL-2是用IL-2基因取代天然白喉毒素受体结合区基因后产生的融合蛋白，对含有丰富IL-2受体的肿瘤细胞如一些白血病细胞具有选择性细胞毒作用。1例使用常规化疗和IFN-γ治疗无效的慢性淋巴细胞白血病病人应用DAB486-IL-2治疗后显示了一定疗效。而DAB389-IL-2则是将DAB486-IL-2分子的无义部分去除后产生的较小分子蛋白，体外研究显示其对靶细胞的杀伤力较DAB486-IL-2强10倍，而不良反应则小得多。目前DAB389-IL-2也已获准开始临床试验。

4．分子外科（molecular surgery）　所谓分子外科是指使用分子技术治疗肿瘤可像外科手术一样将需去除的肿瘤细胞杀灭干净。目前该技术已至少有三种技术路线可供选择，其一是反转录病毒载体携带单纯疱疹病毒的胸苷激酶（HS-TK）基因转染肿瘤细胞，使癌细胞对抗病毒药Ganciclovir（GCV）敏感。Culver等将其用于实验性脑肿瘤的治疗，将能稳定分泌带有HS-TK基因的反转录病毒载体的小鼠成纤维细胞直接注入脑胶质瘤瘤体内，由于反转录病毒仅感染分裂期细胞，故只进入胶质瘤细胞使之表达HS-TK而不进入正常脑组织细胞。5d后，用GCV治疗，发现大鼠脑胶质瘤可完全消退，实验组14只大鼠中有12只经巨检和显微镜检查均未找到癌细胞，余2只大鼠仅在显微镜下发现少量不表达HS-TK基因的成活瘤细胞。虽然使用本法进行基因转移时仅约60%的瘤细胞感染反转录病毒载体，但消退的瘤细胞却近乎100%，显示出旁观者效应（bystander effect），且对正常神经组织几乎无损伤，其原因有待研究。由于此技术不仅可用于脑胶质瘤，也可用于治疗各种肿瘤的脑转移，故该研究结果发表后，RAC便批准进行20例临床试验，显示该技术具有巨大的临床应用潜力。第二种方法是一种具有靶向性的前体药物疗法，其原理为：将水痘-带状疱疹病毒（VZV）的胸腺嘧啶核苷激酶（thymidine kinase，TK）基因与某种肿瘤相关抗原如甲胎蛋白（AFP）或癌胚抗原（CEA）基因的启动子连接，整合至反转录病毒载体，再感染宿主细胞，当此病毒载体感染肿瘤细胞后，由于靶细胞内有肿瘤相关抗原基因表达启动所需的适当的酶系统，故此肿瘤相关抗原的启动子即被激活而启动TK基因表达，此TK可催化无毒药物前体6-甲氧基嘌呤阿拉伯糖核苷（AraM）生成具有很强细胞毒性的三磷酸阿拉伯糖核苷（AraATP）而杀伤肿瘤细胞，此即所谓病毒导向的酶解药物前体疗法（VDEPT）。第三种方法是将细菌的胞嘧啶脱氨酶（cytocine deaminase，CD）基因整合至瘤细胞，此基因可使无毒药物前体5-氟尿嘧啶转化为5-氟尿嘧啶而杀灭肿瘤细胞。将CD基因与CEA启动子一起构建的VDEPT系统将可望用于治疗大肠癌的肝转移。后两种方法目前在动物实验中均取得类似外科手术的疗效，但尚未开始临床应用。

5．使用肿瘤疫苗的基因治疗　运用基因工程技术制备肿瘤疫苗是当前生物反应调整疗法研究的又一热点。目前其主要的研究途径有：①将外源基因直接注入肿瘤。近年来发现，肿瘤相关抗原（tumor associated antigen，TAA）与T淋巴细胞抗原受体（TCR）的结合仅能使T细胞识别肿瘤细胞，要激活T细胞还需特定抗原递呈细胞（antigen presenting cell，APC）表面的B7分子与T细胞表面CD28分子结合形成“双信号”或“共刺激”，这样才能产生有效的T细胞介导的抗肿瘤免疫反应。美国密西根大学医学中心的Nabel用HLA-B7基因给晚期黑色素瘤病人行瘤体内注射，并用脂质体包裹B7基因以增加其吸收，期望B7基因整合表达后可促进T细胞性抗肿瘤免疫；此研究预计将治疗12～15例晚期黑色素瘤病人。②细胞因子基因修饰肿瘤细胞。利用整合细胞因子基因的肿瘤细胞分泌细胞因子刺激肿瘤局部的免疫效应细胞的激活、增生并浸润于瘤区内，是肿瘤疫苗概念的新扩展。已有学者发现用转导后能分泌GM-CSF的灭活肿瘤细胞接种小鼠可诱导很强的、长期的特异性抗肿瘤免疫力。美国Memorial Sloan-Kettering癌症中心已获准进行的一项临床试验将使用IL-2基因修饰癌细胞，并用放射线将其灭活，注射于患者四肢局部用于治疗。他们发现这些灭活的癌细胞至少还能分泌IL-2　2～3周，该研究计划治疗黑色素瘤和肾癌各12例。③病毒基因修饰肿瘤相关基因。将具有强抗原性的病毒抗原基因与抗原性较弱的肿瘤相关抗原（TAA）基因偶联，借此增强机体对肿瘤抗原的免疫反应性，是制备多肽肿瘤疫苗的又一途径。Kantor等将牛痘病毒基因与CEA基因联接，构建成重组多肽疫苗rV（NYC）-CEA，在抗结肠癌动物实验中发现可诱发强大的细胞介导的和体液介导的抗肿瘤免疫反应。

6．针对造血干细胞的基因治疗　目前肿瘤化疗失败的主要原因之一是病人初次化疗时由于骨髓抑制而未能耐受足量的全程化疗，故使用MDR基因保护宿主造血干细胞使之能耐受全程化疗一直是人们研究的目标。由于骨髓干细胞的分离、鉴定及体内外基因转移和稳定表达并不容易，故目前这方面的研究虽已取得不少进展，但其临床应用研究尚未开始。