半薄切片制作

标准的半薄切片是厚度为0.5~1μm的薄片。半薄切片图像的清晰度、分辨率远优于石蜡切片,视野大于超薄切片,有利于获得高质量的光镜图像,是电镜超薄切片技术中一种有效的定位方法。

(一)半薄切片制备

半薄切片的制备仍然包括取材、固定、脱水、浸透、包埋、切片和染色,但其中的一些关键技术如切片、捞片、染色等也不同于超薄切片和石蜡切片,有其特点和难点。

1.切片 用半薄切片机或超薄切片机将已适当修整过的固化包埋块切成厚度为0.5~ 1μm的薄片(半薄切片),在处理干净的载玻片(可预先涂上蛋白甘油)上滴一滴水,用镊子将半薄切片转移至水滴之上,在表面张力作用下,切片会自然展开铺平,尔后吸干多余水分,烘干。

2.染色

(1)常用染色剂配制:①甲苯胺蓝溶液:甲苯胺蓝1g,0.2mol/L磷酸缓冲液(p H7.2~7.4)100ml,混匀,室温保存。改良硼砂甲苯胺蓝溶液因组织细胞着色更好,目前常用,其配制方法如下:甲苯胺蓝1g,硼砂1g,先将硼砂加入100ml去离子水加热溶解,然后加入甲苯胺蓝,滤纸过滤备用。②次甲基蓝-碱性复红多色染液:碱性复红0.05~ 0.1g,次甲基蓝0.2g,蒸馏水各100ml,分别配好后放置1~2d,按1∶1比例混合,配制成次甲基蓝-碱性复红多色染液,根据配制后染色液在组织中着色状态酌情加入1%氢氧化钠无水乙醇溶液或6N盐酸。若胞核着色不足,可在每50ml溶液中加入1%氢氧化钠无水乙醇溶液1~2滴;若胞质间质着色不足,可在每50ml溶液中加入6N盐酸1滴。大多数情况是碱性复红着色佳,次甲基蓝着色较弱,故一般将染液调的偏碱为好。

(2)染色过程:将切片置于70~80℃电热板或酒精灯上加热烤干,滴加染液,加热20~30s,离火。稍凉,自来水冲洗,蒸馏水洗,烤干。树胶固封或不固封。

(二)半薄切片的观察和应用

半薄切片制备完成后,即可用光学显微镜进行观察。

1.了解样品质量,以确定是否继续做超薄切片。

2.半薄切片定位。固化包埋块顶部组织面积过大难以切除合格的超薄切片,需要修面积约0.3mm×0.3mm凸“点”,如果盲目地修可能会把准备观察的部分修掉。因此通过半薄切片,用光学显微镜观察,能够准确定出用于电镜观察的有价值的凸“点”部位,在解剖显微镜下将其四边组织修去,将固化包埋块顶部修成凸“点”,用于超薄切片制备。

3.用于同超薄切片的对照观察,了解亚细胞变化的“宏观形态”。

4.半薄切片有时可以得到比一般石蜡切片更清晰的图像,便于定量形态学分析。