非特异染色的控制

免疫组织化学染色过程中出现的不属于特异性抗原抗体反应的染色统称非特异性染色。造成非特异性染色的原因主要有:组织自发荧光、内源性过氧化物酶或碱性磷酸酶、内源性生物素、胶原和结缔组织等所带电荷吸附抗体或试剂质量差,如抗体不纯、标记的酶或荧光不纯或过量等。因此,染色过程中要针对这些因素采用相应方法减弱或消除非特异性染色,提高染色特异性。

(一)内源性过氧化物酶控制

红细胞、中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和组织内含有丰富的内源性过氧化物酶。应用过氧化物酶染色体系时,需要用3%过氧化氢水溶液或0.3%~0.5%过氧化氢-甲醇液处理15~30min,以阻断内源性过氧化物酶造成的非特异性染色。由于该反应能导致待测抗原变性,减弱特异性染色,故可放在第一抗体反应后,以减少抗原破坏对染色的影响。

(二)内源性碱性磷酸酶的控制

肝、胎盘、小肠绒毛、骨基质、肾小管上皮等组织均有活性很高的内源性碱性磷酸酶。应用碱性磷酸酶反应体系时,常在一抗反应前用左旋咪唑(1mol/L)处理30min,去除内源性碱性磷酸酶活性。效果不理想时,可加0.005mol/L酒石酸。

(三)内源性生物素的控制

正常组织细胞,尤其是肝、脾、肾、脑、皮肤等含有较丰富的生物素。应用生物素-卵白素系统时,需要先将组织切片浸于卵白素(0.5μg/ml)中15min,缓冲液洗净后,移浸于饱和生物素溶液15min,再用缓冲液洗去多余的生物素饱和液,以消除内源性生物素活性,也可用阻断试剂盒(按说明书操作)。

(四)带电荷组织对抗体非特异性吸附的控制

胶原和结缔组织、变性和(或)坏死的细胞、嗜酸性粒细胞等组织或细胞带有正电荷,易与抗体发生静电吸引,引起非特异性染色。为防止这种现象,应在滴加一抗前滴加与二抗来源相同动物的灭活非免疫血清或与一抗来源不同动物的非免疫血清,浓度为1∶5~1∶20。必要时可加2%~5%牛血清白蛋白,室温作用10~30min。

(五)试剂问题

抗体是决定免疫组化染色特异性的关键。因此,在抗体选择、保存和使用过程中都应避免可能会造成非特异性染色的因素。因多克隆抗体易产生背景着色,稀释抗体时可用含1%非免疫血清、p H为7.2~7.6的PBS液。