(一)Gomori钙钴法
1.孵育液配制 将2%β-甘油磷酸钠2.5ml,2%巴比妥钠2.5ml,2%硝酸钙(calcium nitrate)5.0ml,1%氯化镁(magnesium chloride)0.25ml与蒸馏水1.25ml混合,调校p H至9.0~9.4。
2.操作方法
(1)冷冻切片吹干丙酮固定或石蜡切片脱蜡至蒸馏水。
(2)切片置入孵育液37℃、孵育30~120min或以上。
(3)蒸馏水冲洗1min。
(4)用2%硝酸钴水溶液孵育5min。
(5)蒸馏水洗1min。
(6)用1%硫化铵处理1min。
(7)流水冲洗5min以上,蒸馏水洗。
(8)常规脱水。
(9)透明,封固。
3.结果 细胞核:红色;碱性磷酸酶活性部位:黑色。
(二)α-磷酸萘酯法
1.孵育液配制
(1)试剂:α-磷酸萘酯钠10mg,p H10.0、0.2M的Tris缓冲液与固(快)红(fast red)。
(2)配制方法:用Tris缓冲液溶解α-磷酸萘酯钠,再加入固(快)红,充分混合后将p H调校到9.0~9.4,过滤即用。
2.操作方法
(1)冷冻切片贴于硅化载玻片,吹干后冷丙酮固定5~10min。
(2)蒸馏水洗。
(3)用上述孵育液孵育切片(37℃)30~60min。
(4)蒸馏水洗。
(5)用2%甲基绿(氯仿提纯过)染色1min。
(6)自来水洗,蒸馏水洗。
(7)甘油明胶封片。
3.结果 细胞核:绿色;碱性磷酸酶活性部位:灰红色。
4.注意事项
(1)如孵育后酶活性部位显色较淡,可延长孵育时间,但应注意背景,不要有其他非特异性沉淀。
(2)石蜡切片的孵育时间可在5h左右。
(3)重氮盐也可用固蓝B盐(fast blue B salt),用它时酶反应活性部为紫黑色,此时核对比染色应改用核固红或中性红。
(三)磷酸萘酯AS-TR(或AS-BI)法
1.试剂配制
(1)试剂:N,N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethyl formamide)10ml,0.1M碳酸钠2~ 6滴与蒸馏水10ml。
(2)储存液配制方法:用二甲基甲酰胺溶解AS-BI,加入蒸馏水,再加碳酸钠调校p H至8.0。然后再加蒸馏水300ml,p H 8.3、0.2M的Tris缓冲液180ml,备用,可储存数月。
(3)孵育液配制:储存液10ml加固红10mg,搅拌到彻底溶解后过滤,即可使用。
2.操作方法
(1)冷冻切片贴于硅化载玻片吹干,冷丙酮固定5~10min。
(2)蒸馏水洗。
(3)室温下孵育液孵育20~30min。
(4)自来水洗,蒸馏水洗。
(5)甲基绿细胞核染色1min。
(6)自来水洗,蒸馏水洗。
(7)甘油明胶封固。
3.结果 细胞核:绿色;碱性磷酸酶活性部位:红色。
4.注意事项
(1)调校孵育液p H时,注意不要使之过碱。
(2)该法反应较快,不要过度孵育,以免产生背景沉淀。
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