病理标本固定及常用固定液

(一)标本固定

固定是指将组织浸入某些化学试剂或用其他方法使细胞内的物质(包括抗原)尽可能保持在其原来生活状态时的形态和位置的过程。所用化学试剂称为固定剂或固定液。除冷冻切片可不经固定直接切片外,固定是制作其他组织切片不可缺少的步骤,任何需要制作其他切片的标本都必须首先固定。良好的固定是制成优质组织切片的基础,也是特殊染色、组织化学、免疫组织化学和组织原位分子杂交等技术方法赖以成功的基础。固定不良造成的损失,在制片后续的任何阶段皆无法弥补。

1.固定的目的

(1)阻止离体细胞、组织自溶。组织离体后,失去氧的供应,细胞死亡,溶酶体膜破坏并释放出溶酶体酶将细胞溶解,称为自溶。固定可立即杀死细胞并将溶酶体膜性结构及溶酶体酶固定,阻止自溶发生。

(2)防止腐败。杀灭细菌及腐败菌,避免组织腐败。

(3)保持细胞生活时原状。使细胞微细结构、核有丝分裂等保持在活细胞的形态。

(4)凝固蛋白质等物质。凝固细胞、组织的蛋白质、脂肪、糖类、酶、色素、微生物等成分,使它们不会溶解或消失,保持原有形态和位置,有利于镜检定位。

(5)硬化组织,便于制片。固定剂能使细胞、组织中的胶体(半液体)变为凝胶(半固体),增加组织硬度,有利于切片。

(6)改变细胞、组织和对不同染料的亲和力并产生不同的折光率,便于染色、观察。

2.固定的方法

(1)浸泡固定法:指将标本直接浸入固定液固定的方法,是临床病理最常用的固定方法。固定液的量要充足,其体积应是标本体积的5~10倍。有特殊要求者应事先选定相应固定液,如检查糖原,固定液应选无水乙醇。

(2)注射或灌注法:指将固定液直接注入或灌注到血管、腔道内使整个器官或机体充分固定的方法。多用于整个器官(如经支气管灌注固定肺)或尸体(如经颈总动脉注入固定整个尸体)的固定。

(3)微波固定法:指用微波使浸入生理盐水或固定液中组织内的极性分子发生快速运动,产生热量,致使蛋白凝固、组织固定的方法。该方法固定组织具有核膜清晰、染色质均匀、收缩小、无污染等优点,但微波辐射穿透力较弱,大块组织固定时,其中心部位常达不到固定要求。目前主要用于少量或小块组织快速制片时的固定。

(4)蒸汽固定法:指利用固定剂加热产生的蒸汽固定组织中可溶性物质的方法,主要用于血液或细胞涂片及某些薄膜组织等小而薄标本的固定。常用固定剂有甲醛、三聚甲醛等。

3.固定注意事项

(1)取材、固定要及时:手术切除标本应及时切开取材,所取组织块应立即放入固定液(越快越好),以便尽可能地保存组织细胞的形态结构和抗原性。

(2)固定液量要充分:固定液的量一般应为被固定组织体积的5~10倍。装标本的容器宜大些。如果标本因过大或含气体(如肺)而露出液面,组织表面要用固定液浸湿纱布或脱脂棉覆盖,以免组织被风干。

(3)固定时间要适度:固定所需时间与固定液种类、组织大小、室温等有关,多数组织需24h,大标本时间更长。固定时间太短,组织固定不充分,达不到固定要求;固定时间过长,如用福尔马林固定,甲醛会变为甲酸,影响核着色;甲酸与血红蛋白发生化学反应会使福尔马林色素析出。固定时间过长还会使组织抗原活性降低。

(4)固定液浓度要适宜:固定液浓度过低起不到固定效果,过高则穿透性降低,导致组织周边部固定好,而中央固定不良。

(5)固定温度要适当:低温会减慢固定速度,反之加快,但最好不要加热固定。可设定自动组织脱水机的恒定温度在有限时间内完成固定。一般固定温度应控制在36~38℃。

(6)固定材料要清洁:被固定组织块表面如有血液、污物、黏液、食物、粪便等,应先用生理盐水洗净,再投入固定液。

(7)特殊标本要特殊处理:对脾、淋巴结等包膜较厚的脏器,应切取小的薄片单独固定,对于宫颈锥切及胃肠等空腔器官标本应及时钉板展开固定,以保持组织原有形态。

(8)操作方式要规范:一些固定液有毒甚至剧毒(如锇酸),配制、使用时要严格按操作规范进行。

(二)常用固定液

固定液的种类很多,每种有各自的用途和特点,由单一化学物质组成的固定液称为单纯固定液,如甲醛、乙醇、丙酮、冰醋酸、苦味酸、重铬酸钾、锇酸、氧化汞等。由多种化学物质混合配成的固定液称为混合固定液或复合固定液。除甲醛、乙醇及丙酮可用作单纯固定液外,其他多是混合固定液中的一种成分。

固定液各有优缺点,如无水乙醇可固定肝糖原,但不能用于脂肪固定,因脂肪易溶于乙醇。锇酸能固定脂肪,氯化汞固定蛋白质效果较好,冰醋酸能固定核蛋白等。它们多只是对细胞的某些成分固定较好,而不能固定细胞的所有成分。选用适合的复合固定液,取长补短,则能得到较好的固定效果。良好的固定液可使组织固定均匀、收缩小,并且有利于保存组织细胞的抗原性。

实际工作中,要根据病理检查目的,选用适合的固定液。下面是一些常用固定液的配制方法及适用范围。固定液最好随配随用,并应注意其浓度和酸碱度。

1.浓度10%福尔马林(浓度4%甲醛)

(1)配方:福尔马林(40%甲醛)10ml加水90ml。

(2)理化特性:甲醛(formaldehyde)是一种无色,有强烈刺激性气味的气体,易溶于水、醇和醚,极易挥发。一般市售的是含甲醛40%的水溶液,商品名为福尔马林(formalin),由甲醛气体饱和于水而成,比重为1.12。该液体久存(特别在寒冷气候下)会形成白色三聚甲醛(又名副醛,加热可重新分解成甲醛)沉淀,过滤后仍可使用。甲醛不能沉淀白蛋白及核蛋白,但能与蛋白质结合,是应用最广,且使用方便的固定液,尤其对脂肪、神经组织固定效果更好。甲醛是一种还原剂,易被氧化产生甲酸,故不能与锇酸、重铬酸钾、铬酸等氧化剂混合。甲酸使溶液呈酸性,影响细胞核着色,可在甲醛溶液中加入少量碳酸镁或碳酸钠中和。

(3)优点:成本较低、透性强、组织收缩小、固定均匀,固定后组织硬度适当(大于乙醇),能保存脂肪和类脂体(故可用于冷冻切片),对染色体、线粒体、高尔基体具有良好的固定作用,又是糖的保护剂。

(4)缺点:甲醛可溶解尿酸盐,故不能保存组织内的尿酸盐类结晶。甲醛易挥发,污染环境,又可使标本干涸。另外,甲醛固定时间较长的组织,尤以多血的肝、脾组织,甲酸会与血红蛋白结合形成棕黑色福尔马林色素颗粒,这种色素不溶于水、乙醇、丙酮等。福尔马林色素不含有铁,普鲁士蓝反应阴性,可用该反应与含铁血黄素鉴别。

用中性或微碱性福尔马林固定能避免福尔马林色素形成,也可用其他方法去除福尔马林色素。①什端(Schriade)法:浓度75%的乙醇200ml,浓氨水(浓度28%氨水)1ml;石蜡切片脱蜡后放入该液体中处理30min,流水冲洗后染色。若色素未被洗去,可延长处理时间,此法不损害组织。②费罗(Verocay)法:浓度80%乙醇100ml,加入1%氢氧化钾1ml。切片脱蜡至80%乙醇,放入上述液体中浸泡10min,然后流水冲洗2次,每次5min,再入80%乙醇,然后水洗、染色。

必须指出,10%福尔马林对抗原的破坏程度强于10%中性缓冲福尔马林,目前多用后者。

2.浓度10%中性缓冲福尔马林(4%中性甲醛、p H为7.2~7.4)

(1)配方:浓度40%甲醛100ml、无水磷酸氢二钠(Na2 HPO4)6.5g,磷酸二氢钠(Na H 2 PO4·H 2 O)4g,加入蒸馏水900ml。在选择试剂的时候应该注意购买的试剂Na2 HPO4和Na H 2 PO4是否含有或含有几个水分子,根据M=m/n进行换算,准确称量配制并检测缓冲液的p H,避免发生失误。

(2)特点:除具备上述10%福尔马林固定液优点外,对抗原保存作用更好。能满足常规HE、免疫组织化学及原位杂交等分子生物检测的固定要求,可较长时间保存组织(半年至1年),且不影响制片和染色,无特殊要求标本均可使用,是目前病理工作中使用最多的固定液。固定液配制后应密封并在阴凉处保存。

3.乙醇-醋酸-甲醛混合固定液(AAF固定液)

(1)配方:浓度40%甲醛10ml、冰醋酸5ml加入95%乙醇85ml。

(2)优点:兼有固定和脱水作用。醋酸能防止乙醇引起的组织收缩,福尔马林固定染色效果较好,可避免分别使用三种固定液造成的组织收缩或膨胀。对脂类、糖原、蛋白质固定速度快;常温下,5mm厚组织固定4h;加温(60℃)时,固定30min。固定后组织直接放入95%乙醇脱水。该液既是固定剂,也是保存剂,组织可较长时间存放其中保存备用。

(3)缺点:对细胞膜蛋白质和细胞内某些结构有一定破坏作用,可能影响免疫组织化学染色效果。固定后不经水洗,组织中会有福尔马林残留。

4.Bouin固定液

(1)配方:苦味酸饱和水溶液75ml、40%甲醛20ml加冰醋酸5ml。

(2)特点:使用前配制,是一种良好的外科活检标本常规固定液,渗透迅速,固定均匀,组织收缩少;也可作媒染剂使用。冰醋酸对胶原纤维等组织有膨胀作用,甲醛对组织有收缩作用,二者混合可抵消彼此的不良反应。该液对结缔组织、脂肪的固定作用较好,是骨髓、结缔组织的优良固定液;适用于结缔组织染色,尤其对三色染色较为理想;对骨组织有一定的脱钙作用,可用于少量骨组织脱钙(如骨髓);对脂肪组织固定效果也较好,适用于含脂肪较多的淋巴结、脂肪瘤、乳腺等组织标本的固定。固定时间为12~24h。该液固定后的组织被染成黄色,必须用流水冲洗4h以上,否则会影响染色效果。

5.乙醇(酒精alcohol)

(1)配方:无色透明液体,可与水以任何比例相溶,固定液浓度为80%~95%。

(2)特点:可保存尿酸结晶和糖原等物质,但经其沉淀的糖原,仍可溶解于水。因此,肝糖原经它固定后不能在低于70%乙醇中保存。因其有渗透力弱、固定速度慢、会使组织变脆、价格较贵等缺点,一般不作常规使用。乙醇可溶解脂肪、类脂体,故它们不能用乙醇固定。由于核蛋白易溶于水,所以乙醇固定标本的细胞核染色效果不良。乙醇可沉淀白蛋白、球蛋白、核蛋白,有轻度的蛋白变性作用,固定后可再溶解,染色过程中,温育时间长会使抗原性及反应强度减弱,不利于免疫组化染色。乙醇是一种还原剂,不能与重铬酸钾、锇酸、铬酸等氧化剂混合使用。

除固定作用外,乙醇还具有硬化和脱水作用,因此在制片过程中有很多用途(见后常用脱水剂)。

无水乙醇容易挥发,也容易吸收空气中水分,存放时瓶盖必须塞紧;为了吸去其中水分,常在无水乙醇瓶内放入少量无水硫酸铜粉末。

70%乙醇可作保存液,大体标本经福尔马林固定后,如果用福尔马林作陈列标本的固定液,因为福尔马林含杂质较多,液体容易酸化,时间久后会逐渐变为微黄色或淡黄色,影响陈列效果。必须将标本取出冲洗,然后移入70%乙醇,陈列。

6.醋酸(乙酸、冰醋酸acetic acid)

(1)配方:醋酸能以各种比例与水及乙醇混合,固定液浓度为0.3%~5%。

(2)特点:醋酸为有刺激性气味的无色气体,低于15℃时结成冰状结晶,故又名冰醋酸。冬天使用前可用微波炉解冻。醋酸穿透力很强,不能保存糖,不能固定脂肪及类脂,不能沉淀白蛋白、球蛋白,但能很好地沉淀核蛋白,对染色质的固定效果很好。固定染色体的固定液几乎都含醋酸。醋酸会破坏线粒体和高尔基体,固定它们的固定液都不含醋酸。很多固定液对组织有收缩的作用,尤其对富含纤维的组织,而醋酸不但不会使组织收缩,还能使组织膨胀,与其他试剂配合使用,能抑制它们对组织的收缩作用。醋酸固定的组织可不必水洗,直接入70%乙醇。

7.重铬酸钾(potassium dichromate)

(1)配方:备用液为5%水溶液,固定液为1%~3%水溶液。

(2)特点:重铬酸钾为橘红色结晶,不能沉淀蛋白质,可使蛋白质变为不溶性,若在溶液中加入醋酸后会形成铬酸,也能沉淀蛋白质,使染色质得以保存,但线粒体遭到破坏。未酸化的重铬酸钾对细胞质固定效果较好,且能固定类脂质,使其不溶于脂溶剂,所以对线粒体、高尔基体的固定效果很好,另外其穿透力极强,固定后组织几乎不收缩。缺点是不能固定糖,且溶解染色质。固定后的组织必须流水冲洗12h以上,否则标本会变硬脆化,不易制成切片。如不能当即制作切片,可将标本保存于福尔马林液内。重铬酸钾为强氧化剂,不能与酒精等还原剂混合,与甲醛混合时,需要用前配制,不能久存。

8.苦味酸(picric acid) 苦味酸是一种强酸,为黄色晶体,易燃易爆,制成饱和溶液贮藏较安全,能沉淀蛋白,也有软化组织及一定的脱钙作用,但无固定脂肪和类脂质作用。固定后的组织必须流水冲洗4h以上才能脱水。多与其他液体配合使用,如Bouin液。

9.氯化汞(升汞,corrosive mercuric chloride)

(1)配方:常备溶液为7%饱和水溶液,固定用浓度常为5%水溶液。

(2)特点:化学纯品为针状结晶,易升华,能溶于水和乙醇。氯化汞是一种蛋白沉淀剂,用其固定的组织染色时胞质着色较鲜丽,对细胞核结构保存效果也较好,但对脂类、糖固定作用差,且组织收缩作用明显,很少单独使用,常与拮抗此缺点的醋酸、福尔马林、重铬酸钾等试剂配成混合固定液使用。因其穿透速度慢,只适宜固定薄片组织。用含氯化汞固定剂固定组织超过规定时间会使组织过度硬化,难切成薄片。组织内存有汞盐,切片时会损伤切片刀,所以脱水前应予以洗去。常用方法是切片脱蜡后用70%乙醇加入少量碘配成0.5%碘酒浸洗脱汞,再以5%硫代硫酸钠漂洗脱碘,流水彻底冲洗后再染色。用升汞饱和液固定组织时,需临时加5%冰醋酸,2~3mm厚的组织块固定6~18h,然后用水洗24h,再入80%乙醇保存。氯化汞能腐蚀金属,混有它的固定液不能用金属容器盛装,它固定的标本也不能用金属镊子夹持。氯化汞有剧毒,应妥善保管。

10.铬酸(chromic acid)

(1)配方:固定液浓度为0.5%~1%。

(2)特点:铬酸为三氧化铬的水溶液,有暗红色或带暗紫色块状结晶,具有强酸性及腐蚀性,剧毒,易潮解,为强氧化剂,不能与乙醇、福尔马林等还原剂混合使用。否则还原为氧化铬失去固定作用,铬酸与乙醇、乙醚少许接触即可引起爆炸,应置于暗处保存。它是Orth液等复合固定液的构成成分。铬酸可沉淀所有的蛋白质,对核蛋白固定效果良好,并可保存糖类,但对脂肪无固定作用。铬酸可将糖类转变为醛,水解DNA将其戊糖转变为一种醛。因此,它固定的DNA和糖类不需经过常规PAS或Feulgen染色的前处理,即可与Schiff试剂呈阳性染色。铬酸渗透力较低,对标本收缩轻微,铬酸固定剂固定的组织与用重铬酸钾固定一样也需彻底水洗(≥24h),洗去组织中全部铬酸,否则脱水时铬酸与乙醇反应生成氧化铬沉淀,使组织脆化,且不易着色。

11.锇酸(osmic acid)

(1)配方:固定液浓度为0.5%~1%。

(2)特点:锇酸即四氧化锇,为白色或淡黄色结晶,能使蛋白质固定均匀,不产生沉淀,能很好地保存细胞细微结构,与铬酸、重铬酸钾、冰醋酸等配合,对细胞核、细胞质、尤其是线粒体、高尔基复合体固定良好,主要用于电镜制片的组织固定,也是脂肪及类脂质的良好固定剂,其固定的脂肪及类脂质呈黑色。锇酸穿透力弱,只适合固定小块组织,且易使组织变硬。锇酸常温下有挥发性,会损伤眼、黏膜、皮肤等,用时要注意防护。它作为强氧化剂不应与乙醇、甲醛等还原剂混合。由于易还原为黑色沉淀,配制好的储备液需置于暗处冷藏保存。

12.丙酮(acetone) 丙酮为无色透明液体,有芳香气味,极易挥发,能沉淀蛋白质,穿透速度快,适用于酸性磷酸酶、碱性磷酸酶的固定。缺点是引起组织收缩及硬化作用明显,使细胞核染色不佳。常与氧化汞、甲醛混合使用。

13.B-5固定液(醋酸钠-升汞-甲醛固定液)

(1)配方:无水醋酸钠1.25g、升汞6g加入蒸馏水90ml,用前加入甲醛10ml。

(2)特点:组织收缩及硬化作用明显,常用于固定骨髓活检及淋巴组织,但会使细胞核染色不佳。因含有汞沉淀,染色前要行脱汞处理。

14.Zenker液

(1)配方:重铬酸钾2.5g,升汞(氯化汞)5g,蒸馏水100ml与冰醋酸5ml。

先将重铬酸钾和升汞溶于蒸馏水,重铬酸钾要用热水或加温(40~50℃)溶解,冷却后过滤,储存于带盖的棕色玻璃瓶。储存液若暴露于空气中,该溶液将会被氧化使颜色加深、失效。临用时,取储存液95ml,加入5ml的冰醋酸,即可使用。

(2)特点:固定液不能用金属器皿盛放,也不要用金属镊夹取固定后组织,固定12~ 36h后取出组织,流水冲洗12h以上,然后入75%~80%乙醇保存。切片染色前必须用0.5%碘酒脱汞。该固定液固定组织的细胞核、细胞质染色清晰(如骨骼肌的横纹清晰),对免疫球蛋白固定效果尤好,对病毒包涵体的固定效果也较好,但其含有醋酸,不能用于保存含血多的标本,如淤血的肝、脾等。

15.Carnoy液

(1)配方:无水乙醇60ml,氯仿30ml与冰醋酸10ml配成100ml的Carnoy液。

(2)特点:该液穿透力强,可很好地固定细胞核,特别适合于固定外膜致密组织,亦适用于糖原及尼氏小体固定。该液不能保存脂类,不适合脂肪固定,也不能作保存剂。固定后组织无需水洗即可入95%或无水乙醇脱水。每次用前临时配制,长时间放置会影响固定效果。