定性实验方法学评价

(一)评价准备

在开展定性实验方法的评价工作之前,操作人员应有一个熟悉和培训的过程,使操作人员掌握样本的处理和保存、试剂的处理和保存、正确的实验过程和结果解释,以及质量控制操作。培训应当在不同工作日内进行,并能使工作人员的操作能力达到临床应用的要求。在使用生产商提供的质控物时,应按生产者的要求进行,使用其他商业质控物必须注意可能存在的基质效应问题。可能时,在进行方法学评价期间,应使用相同的质控物。对大多数定性实验,每日进行阴性和阳性质控物测定已经足够。用于评价实验的临床标本,应按要求采取。必要时,应新鲜采取,并尽快完成检测,在熟悉方法和操作培训过程结束后,可以继续方法学评价工作。

(二)重复性评价

在评价实验期间,应做好质量控制工作,以保证实验在预期的质量目标下进行和实验数据的有效性。质控物可使用试剂生产者推荐的阴性和阳性质控物。重复性评价实验应该提供样品浓度接近临界值时的精密度结果,而用远低于或高于临界值浓度的样品进行定性实验的重复性评价是不适当的。在临界95%区间之外,定性方法给出相同测定结果的能力(阴性或阳性)是评价其方法性能的重要指标。定性实验方法的重复性评价目的,是确立被评价方法的临界值,进一步确立临界±20%的样本浓度范围是否在该方法临界值95%区间内。重复性评价实验可按以下步骤进行。

1.确立方法的临界值。参考试剂说明书或用阳性样品进行稀释,直至重复实验给出的阳性和阴性结果各占50%,此时的样品浓度即为实验方法的临界值。

2.在临界值基础上准备出-20%浓度的样品和+20%浓度的样品。

3.对以上低、高浓度样品分别测20次,记录阴性及阳性结果数;重复次数低于20次时,统计学意义可能降低。

4.当实验结果表明“临界值”样品的阴性结果和阳性结果不是各50%时,原因可能是:被评估的临界值浓度不准确、或结果数据不充足、或方法学剂量反应曲线在临界值处是非线性的。

5.当实验结果表明+20%浓度的样品产生阳性结果数≥95%,同时,-20%浓度的样品产生阴性结果数≥95%,说明临界值±20%浓度范围等于或超出临界值的95%区间,对于被测物浓度±20%浓度范围以外的样品,实验方法将给出稳定的结果。当阳性和(或)阴性结果数<95%时,应另外准备不同浓度的实验样品,重新进行评价。

(三)方法学比较

一般情况下,方法学比较实验采用同一组样品,经2种或2种以上方法同时测定,并对测定结果进行比较。作为对比的方法可以是另一个定性方法(如用户正在使用的方法)、“金标准”方法、定量方法或临床诊断。有时,参考样品组合和能力验证的样品也可用于对定性方法的性能评价。但是,能力验证用的样品往往存在基质效应,从而影响对实验结果的正确评估,特别是当样品中被测物浓度在临界值附近时或被测物分子结构与原始样品不同时。对定性实验进行方法比较研究,应考虑以下几方面的因素。

1.样品种类和数量。进行方法学研究时的样品最好使用常规患者的新鲜标本,样品量应保证评价实验方法和比较方法测定的需要。样品中被测物应稳定,应尽可能用评价方法和对比方法同时完成测定。作为最低要求,用对比方法测定的阴性和阳性样品,应分别在50例以上。常规检测时,为保证阳性样品达到50例,阴性样品可能已大大超过50例,为保证正确评价阳性样品中可能出现的假阴性问题,必须保证有足够的样品量。

2.实验过程使用临床样品进行方法学对比研究应在10~20天内完成,一方面能保证足够的样品量,另一方面也确保对实验方法的评价在常规实验条件下进行。全部实验样品都应妥善保存,以备再次检测用。可以通过对比方法再次测定,或使用另一种对比方法,或使用临床诊断提供更多的信息以解释实验中的问题。

3.参考样品盘由一组临床样品组成,测定结果可与指定的参考方法或临床诊断相联系,对评价定性实验方法是非常有效的。参考样品盘通常包含不同浓度被测物的临床样品,可能时,还包括干扰物质。虽然样品盘有许多优点,适用于评价实验,但是不易得到,也不能反映在实验室条件下患者的实际分布情况和预测效果。参考样品盘与临床患者样品结合,用于方法评价实验是比较好的选择。

(四)数据分析

1.已知诊断结果 定性实验性能通常用敏感性和特异性来描述。在已知样本临床诊断结果的情况下,计算灵敏度和特异性两项指标是最简便的,可采用2×2表格计算定性方法的操作性能,见表7-3。

表7-3 实验方法和金标准比较的2×2表格

(1)方法敏感度=100%×[A/(A+C)]

(2)方法特异性=100%×[D/(B+D)]

(3)相关样品的患病率=100%×[(A+C)/N]

(4)阳性结果预测值=100%×[A/(A+B)]

(5)阴性结果预测值=100%×[D/(C+D)]

(6)方法效率=100%×[(A+D)/N]

2.未知诊断结果 许多情况下样品的临床诊断是未知的,对定性实验方法进行评价时,实验方法只能与对比方法进行比较。由于对比方法的准确度并非100%,此情况下不能简单使用敏感性和特异性来描述方法学性能,应使用“符合率”对实验方法结果与对比方法结果的一致程度进行描述,见表7-4。

表7-4 诊断未知时定性实验方法比较