【标本】新鲜血清。
【试剂】包被好的反应板、酶标记抗体、样品稀释液、洗液、底物A、底物B、终止液等。
【器材】移液器、吸头、37℃恒温箱、洗板机或洗瓶、酶标仪等。
【操作步骤】参照试剂盒说明,一般步骤如下。
1.操作前准备:戴口罩、帽子、手套,穿工作服,准备并清点本试验所需器材。
2.将标本、试剂、试验需用量的板条放置于室温下平衡到同室温相同,未用的板条和干燥剂放回铝箔袋内,密封冷藏。
3.编号。将酶标板条从密封袋中取出,将血清对应微孔板按序编号,设阳性对照孔2孔、阴性对照孔2孔、空白对照孔1孔、室内质控血清孔1孔。
4.稀释。每孔加入20μl样品稀释液。
5.加样。样品孔加待测样品100μl,阴性对照孔加阴性对照液100μl,阳性对照孔加阳性对照液100μl,室内质控血清孔加外部对照质控血清100μl,空白对照孔不加样品和酶标记抗体,只加底物和终止液。振荡混匀。
6.温育。覆盖黏胶纸封盖反应板,置37℃孵育60min。
7.配液。按要求稀释浓缩液配制洗涤液。
8.洗涤。取出已孵育完毕的反应板,弃去黏胶纸,甩干孔内的液体,用洗板机充分洗涤5遍或手工洗板,将板拍干。
9.每孔加样品稀释液50μl,取新黏胶纸覆盖反应板,置37℃孵育30min。
10.洗涤步骤同8。
11.每孔加底物A、B各50μl,置37℃孵育30min。
12.每孔加终止液50μl,振荡反应板,使之充分混匀,避光。
13.打开酶标仪,预温仪器,于450nm波长处读取吸光度,以空白孔校零点,分别测定阳性对照、阴性对照、室内质控及样本孔的A值。
14.计算Cut-off值和S/CO值,判断结果。
15.操作后正确处理医疗垃圾,实验器材归回原位。
【注意事项】
1.标本要充分离心,无纤维蛋白凝块,以免纤维蛋白黏附在板上洗板时不易洗去,影响显色。
2.试剂应平衡到室温。
3.血清应加量准确,垂直加入板孔底部。
4.整块板均匀、避光温育,确保受热均匀。
5.振荡混匀要充分。
6.洗板机注水要充满整个微孔,板孔内残留液要尽量少。
7.底物A、底物B、终止液加量要准确。
8.显色后避光,在规定时间内比色。
【技能要点】
1.熟悉ELISA实验每步操作要领和注意事项。
2.熟悉Cut-off值和S/CO值的计算及判断结果。
(李贵霞 李立新)
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