（一）杀灭分枝杆菌试验
【试验准备】
取龟分枝杆菌脓肿亚种（ATCC 93326）新鲜菌悬液培养物进行试验，菌悬液制备参照本章第二节介绍的方法进行。试验器材和试剂除常规器材、试剂之外，用分枝杆菌专用培养液；应在专门实验室进行试验。
【操作步骤】
1.试验标本制备
（1）悬液定量杀菌试验，参照上述悬液定量试验的脏的条件和清洁条件配制试验菌悬液；用无菌标准硬水配制试验浓度1.25倍的试验消毒液。
（2）载体定量杀菌试验用染菌载体可参照本章第二节的方法；用无菌标准硬水配制试验浓度消毒液。
2.杀菌试验 分别参照悬液定量杀菌试验程序和载体定量杀菌试验程序进行分装消毒液、恒温，加菌，清除残余消毒剂；接种无菌平皿，倒入分枝杆菌专用琼脂培养液；凝固后所有接种培养的平板均放入塑料袋内，于37℃培养1周。
【结果判断】
悬液定量杀菌试验至少重复3次，每次试验杀菌对数值均应≥4.0；载体定量杀菌试验，每次试验杀菌对数值均应≥3.0。
（二）病毒灭活试验
【试验准备】
1.试验代表病毒株 为脊髓灰质炎病毒Ⅰ型（poliovirus-I，PV-Ⅰ）疫苗株；艾滋病病毒1型（Human Immunodeficiency Virus，HIV-1）美国株。宿主细胞可以用VERO细胞系，BGM细胞系，Hela细胞系等。
2.主要器材和试剂 试验应在洁净实验室、HIV应在P3级试验室内进行；细胞培养瓶和培养板，二氧化碳孵箱，细胞完全培养液及其维持液，倒置显微镜和高速离心机，液氮及其他病毒培养器材。
3.病毒悬液制备
（1）病毒复苏培养：从液氮中取出宿主细胞，于37℃水浴中迅速融化，将宿主细胞接种到盛有细胞维持液的细胞管内混匀，立即于3 000r／min，离心3min；弃上清后再加入细胞维持液混匀，重复离心1次；将细胞转种到含完全细胞培养液的培养瓶内，于37℃二氧化碳孵箱内培养至长成细胞单层。
（2）病毒接种培养：取融化的病毒毒种，用细胞维持液稀释10倍，接种到长满单层细胞的细胞培养瓶内，于37℃二氧化碳孵箱内培养至3／4细胞出现病变，收取病毒。
（3）制备病毒悬液：将收取的含有病毒的细胞培养液，经水浴超声破碎细胞，释放病毒；将病毒悬液按每管1ml分装到离心管内；冷冻于－80℃备用，同时取样测定病毒滴度。
4.计算病毒滴度
（1）采取终点稀释法计算病毒感染滴度：用半数细胞感染剂量（TCID50）表示感染滴度。TCID50对数值＝细胞病变率高于50%组稀释度的对数值＋距离比例。
（2）计算过程：计算细胞病变率。计数培养板上不同稀释度细胞病变和未病变的孔数，然后由低稀释度向高稀释度计算细胞病变（－）累积值；再由高稀释度向低稀释度计算细胞病变（＋）累积值。细胞病变率＝各稀释度（＋）累积总值／该稀释度（－）累积总值与细胞病变（＋）累积总值之和即为其病变比。计算距离比例：
距离比例＝
【设计】
以脊髓灰质炎病毒灭活试验为例。本试验以脊髓灰质炎病毒Ⅰ型疫苗株为指标，采样细胞感染法测定消毒处理前后样本中病毒存活量，以接种细胞病变为观察指标，确定病毒感染滴度，计算灭活率。
1.试验组 选择最低有效消毒剂浓度，设计3个作用时间，检验消毒剂对病毒的灭活对数。
2.阳性对照组 用不含消毒剂的试验体系，按试验组程序，测出病毒悬液原滴度。
3.阴性对照组 用不加病毒的试验体系，接种细胞，观察细胞生长完全正常。
【操作步骤】
1.试验标本制备 取出低温冷冻细胞，融化后转种完全细胞培养液的细胞瓶，培养出单层细胞。取出冷冻病毒，融化后用细胞维持液稀释成试验病毒悬液；脏的条件下将病毒悬液与有机干扰物做对倍稀释并分装成每管0.2ml。用无菌硬水将消毒剂配制成试验浓度的1.25倍，置于20℃水浴。
2.灭活 在含0.2ml病毒悬液试管内加入0.8ml试验浓度消毒液，立即混匀；作用至规定时间，取出0.1ml加入到0.9ml中和剂试管内；以同样方法操作阳性对照。
3.接种 终点稀释法，用细胞维持液将样本进行10倍系列稀释，用加样器将每个稀释度样本加到96板孔培养板上（板孔内长成单层细胞），每个稀释度加4孔；置于37℃吸附1～2h，更换细胞维持液，继续于二氧化碳孵箱内培养，每24h观察细胞病变，连续3d。试验至少重复3次。
4.结果观察 观察每个板孔内细胞病变情况，计算平均灭活对数值。
【计算】
灭活对数值计算：
平均灭活对数值＝logN0－logNx
式中：阳性对照组平均感染滴度为N0，试验组感染滴度为Nx。
举例计算详见表29-3。
表29-3 病毒灭活试验结果计算
由表29-2得到，高于50%组病变率为80%，低于50%者为20%，高于50%组稀释度为6。所以，距离比例＝80－50／80－20＝0.5，结果：TCID50对数值为6＋0.5＝6.5
【结果判断】
每次试验灭活对数值均应≥4.0，判定为灭活效果合格。
（杨华明 王长德）
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