免疫细胞化学

免疫细胞化学技术适用于大多数细胞学标本，如痰液、刷片、影像导引穿刺细胞涂片等，当然，最佳的标本还是细胞块，因为它的量比较充足。使用免疫细胞化学技术之前，必须评价细胞学的形态，再选用合适的标记物。

近年来，随着在组织学诊断中发挥重要作用的免疫组织化学技术（immunohistochemistry，IHC）的广泛应用，在细胞学标本上使用免疫细胞化学（immunocytochemistry，ICC），已被证明对肿瘤的分类诊断是重要的，并引起细胞学家的高度关注。事实上，在手术之前或者因各种原因不宜活检的情况并不罕见，有时候细胞学标本是唯一可以从癌症患者身上取得的标本。由于细胞学检查常被用来区分良性、反应性增生和肿瘤及其癌前状态，因此细胞学家重视以形态学区分良恶性细胞，这也是细胞学的优势所在，加之目前没有标记物可以区分良性细胞和恶性肿瘤细胞的现实，细胞学的免疫细胞化学技术主要解决肿瘤类型问题（图7-1～图7-5），而此前在标本问题上的缺陷致使部分肿瘤的类型被诊断错误。

在技术层次方面，由于现在的方法已日趋完善，并且已经可以使用高品质的试剂和实现自动化，技术问题已不再是这一领域的重大关注点。免疫细胞化学（ICC）可以应用于大多数细胞学标本，包括细针穿刺（FNA）、浆膜腔积液、尿液、子宫颈涂片检查，以及灌洗液和刷检标本。上述标本采用液基薄层技术所做的涂片内的细胞相对分散，细胞量丰富，固定及时，单个细胞包括核结构清晰，同一标本可以做3～5张涂片，这些均可以满足免疫细胞化学标记的条件，如果细胞数量很多，可以做细胞块切片，就更能够多做切片和选择多项标记了。表7-1列举了抗体标记的常用相关组合供参考。

图7-1　乳腺淋巴瘤

A．穿刺标本液基涂片中仅见一致性的幼稚型小淋巴细胞；B．细胞块免疫细胞化学LCA（CD45）标记阳性

图7-2　与图7-1同一病例的手术标本组织学所见（A）和穿刺标本电镜下的肿瘤性淋巴细胞（B）

图7-3　肺腺癌

A．涂片（Pap×400）；B．细胞块切片（HE×400）；C．细胞块免疫细胞化学（EMA×400）所见：成团的腺癌细胞

图7-4　恶性间皮瘤标本

A．细胞学巴氏染色（Pap×400）；B．免疫细胞化学染色（Calretinin，SP法×400）所见

图7-5　小细胞癌Pap染色（A）与免疫细胞化学染色（B）

穿刺标本，Pap×400；NSE×400

在液基薄层技术方面，必须选择离心式或有离心步骤的液基制片，膜滤法并不适合免疫细胞化学，因为滤膜会吸收免疫试剂和色素原，使得背景着色而导致染色不合格。膜滤法在洗涤步骤时也很容易出现从载玻片上脱落的问题。浆膜腔积液应用细胞离心涂片法时，如果蛋白质含量高，可能会导致蛋白质薄膜沉淀覆盖于细胞上，从而阻止试剂充分渗透。在这种情况下，离心前使用等渗盐水简单地洗涤细胞将去除过量的蛋白质。细针吸取的和体腔积液的标本，含血液过多时，可能会对免疫细胞化学造成干扰。这些标本可以保存在Saccomanno溶液中，它不仅可以固定标本，还可以溶解红细胞。

免疫细胞化学染色对标本的固定有着严格的标准，固定液包括95%乙醇、95%的异丙醇、或是缓冲甲醛溶液、甲醛-丙酮，还是用乙醇和甲醛溶液的混合液固定的细胞学标本，获得的免疫细胞化学结果都一样理想。要注意风干的标本不适合免疫细胞化学标记，尤其对大多数细胞质和细胞核的标记物来说，这种风干片不能出现最佳标记效果，而且大多数风干标本使用Diff Quick染色法或类似血液染色法。这些染色也干扰需要脱色继续免疫细胞化学标记的程序。长期固定在甲醛固定液中的标本会逐渐丧失抗原性，而乙醇类固定液则无此现象。

免疫细胞化学步骤如下。

（1）在智能控温电加热器上加热载玻片，移除盖玻片（2s）并立即浸泡在二甲苯（2min）中。

（2）下行梯度乙醇水化。

（3）用6%的过氧化氢水溶液阻断内源性过氧化物酶活性（3min，室温）。

（4）将涂片置于抗原修复液（S1699，Dako公司，加利福利亚洲卡宾特利亚），并在90°的压力锅中加热（10min）。

（5）滴加生物素阻断剂阻断内源性生物素（X0590，Dako公司）。

（6）一抗孵育（22min，室温）。

（7）滴加结合液：生物素化抗小鼠免疫球蛋白，并孵育（22min）（K0690，抗体）。

（8）添加链菌素-生物素蛋白-过氧化物酶连接液并孵育（22min）（K0690，Dako公司）。

（9）将涂片置于二氨基联苯胺溶液中（10min）（K33468，Dako公司）。

（10）苏木素复染，Harris苏木精复染（15s）。

（11）如果是细胞核抗原则替换第10步，改为应用1%硫酸铜（1min，室温）作加强指示剂；0．2%碱性孔雀绿（2s）复染。

（12）上行梯度乙醇脱水，二甲苯透明，并封固。所有洗液和稀释液都是由tris缓冲液配制（抗体，S1968）。步骤5到9可以使用自动化仪器（Autostainer Plus，Dako公司）。

微波辐射热诱导抗原修复可能导致免疫细胞化学结果不一致。不锈钢蔬菜蒸笼或压力锅为文火且受热均一，为目前大多数实验室使用。如果修复抗原需要使用蛋白酶消化，则涂片的消化时间应减少至细胞块所用时间的1/5或1/4。细胞标本中免疫细胞化学的目标细胞太少且间隔太远的情况并不少见。为了便于快速识别这些细胞，在做免疫细胞化学之前用墨水圈出该区域。然后用钻石笔在载玻片背面刻出染色面积。免疫染色后，圈中的目标细胞应易于识别。由于细胞学诊断是一种相对快速的诊断形式，制备和储存各种细胞标本作为免疫细胞化学专门使用是不实际的，甚至是不可能的。有文献指出，细胞标本阴性的免疫细胞化学结果不像阳性结果具有意义。

标记物的选择，因细胞学诊断的问题可以由其形态学表现充分而减少到2～3种可能性，因此选择的抗体也仅仅限于2～3种。

表7-1　部分肺肿瘤免疫表型列表

（续　表）

此表根据Muin S．A．Tuffaha，《Phenotypic and Genotypic Diagnosis of Malignancies》，2008年修改