及血型抗体效价测定

1．检验目的

检测血清中ABO及Rh血型抗体效价，为新生儿溶血病的诊断和预防、骨髓移植和干细胞移植后供者细胞存活状态评价提供依据。

2．检验原理

ABO及Rh血型抗体在一定介质条件下与相应红细胞抗原结合后会出现红细胞凝集，不同的凝集强度会间接反映出血型抗体结合抗原的能力（效价）。不同标本在血型抗体反应活性均较高的情况下都会使相应红细胞出现最强凝集（＋＋＋＋），无法真正区分不同标本间血型抗体结合抗原的能力差异。通过将血清（或血浆）连续倍比稀释，观察稀释后血清与相应抗原红细胞凝集反应强度，能够发现不同标本之间血型抗体反应活性的差异或同一受检者不同时期血型抗体反应活性的变化情况。在确定统一凝集强度的情况下[最后一个（＋）]，产生凝集的最高稀释度的倒数即为该标本的抗体效价。

3．适用范围

3.1 ABO血型抗体效价测定

3.1.1 孕妇血型抗体效价检测，用于ABO血型新生儿溶血病风险评估；

3.1.2 骨髓移植、干细胞移植后供者细胞存活状态（嵌合）评价。

3.2 Rh血型抗体效价测定　用于明确产生Rh血型系统不规则抗体的孕妇,以动态评估发生Rh血型新生儿溶血病的风险，主要测定IgG类Rh抗体。

4．设备性能参数

参见KA-2200血清学专用离心机、达亚美ID离心机、达亚美ID孵育器、强生Othro Biovue 离心机使用说明书。

5．器材与试剂

5.1 器材：KA-2200血清学专用离心机、B 600-A型低速离心机、达亚美ID离心机、达亚美ID孵育器、强生Othro Biovue 离心机、塑料软试管、塑料硬质试管（75 mm×12 mm）、试管架、一次性塑料滴管、移液器、一次性移液枪头。

5.2 试剂：DiaMed Coombs卡、Othro Biovue Coombs卡、生理盐水、抗IgG抗体试剂（市售单克隆）、凝聚胺试剂、2-Me、致敏的阳性对照细胞（自制）。

6．样本要求

EDTA-K3或EDTA-K2抗凝全血≥3 ml，经B 600-A型离心机1 760 r/min离心5 min，离心后无溶血及明显乳糜。

7．校准步骤

严格参照KA-2200血清学专用离心机、达亚美ID离心机、达亚美ID孵育器、强生Othro Biovue离心机使用说明书执行。

8．操作程序

8.1 ABO血型抗体效价测定

8.1.1 IgM类抗体测定

8.1.1.1 血清（或血浆）连续倍比稀释　排列10支试管按顺序编号。每管用加样枪各加生理盐水100μl，在第1管中加入待检血清100μl，混匀后移出100μl转至第2管，以同样操作稀释至第10管，从第10管吸出100μl暂时保留在另一试管中，以备必要时作进一步稀释。这样从第1管到第10管的血清稀释度依次是1∶2，1∶4，…，1∶1 024。

8.1.1.2 加红细胞悬液　在每管稀释后的血清（或血浆）各加3%相应红细胞悬液100μl，混匀（如待检血清抗体为抗A，则加入A型标准红细胞悬液；如待检血清抗体为抗B，则加入B型标准红细胞悬液；如待检血清中既有抗A又有抗B，则倍比稀释两份血清，一份加入A型标准红细胞悬液，另一份加入B型标准红细胞悬液）。

8.1.1.3 离心与结果观察　使用KA-2200台式离心机1 000 r/min离心15 s后观察结果。以肉眼观察到最后一个（＋）的凝集管作为判断的终点，终点血清稀释度的倒数即为其IgM类抗体的效价（Titer），或称滴度。

8.1.2 IgG类抗体效价滴定

8.1.2.1 IgM类抗体的破坏　须取适量血清或血浆（0.5或1.0 ml）加等体积2-Me溶液（也可选用DDT试剂）混合，封口，置37℃水浴箱孵育30 min。

8.1.2.2 血清（或血浆）连续倍量稀释：操作步骤同8.1.1.1。

8.1.2.3 效价滴定操作。

8.1.2.3.1 经典间接抗人球法

在倍比稀释血清或血浆中加入3%对应的A型（或B型）红细胞悬液50μl，37℃水浴30 min；

生理盐水洗涤三遍，最后一遍在吸水纸上控干，加抗IgG抗人球蛋白试剂血清1滴，血型血清学专用离心机1 000 r/min离心15 s后观察并记录结果。

8.1.2.3.2 凝聚胺法

在倍比稀释血清或血浆中加入3%对应的A型（或B型）红细胞悬液50μl混匀；

各试管分别加LIM液0.65 ml，充分混合均匀后，再各加Polybrene溶液2滴，并混合均匀；

血型血清学专用离心机Ⅱ挡（1 000 r/min，15 s）离心，把上清液倒掉，不要沥干，让管底残留约0.1 ml液体；

轻轻摇动试管，目测红细胞有无凝集，如无凝集，则必须重做以上步骤；

最后加入Resuspending液2滴，轻轻转动试管混合并同时观察结果。如果在30 s～1 min内凝集散开，为阴性；如凝集不散开，则为红细胞抗原抗体结合的特异性反应，需要具体判断凝集强度。

8.1.2.3.3 DiaMed Coombs卡式法

撕掉Coombs卡上的锡箔，在每一个反应孔下做好标记；

依次在每孔中加入0.8%的A型（或B型）红细胞悬液50μl和倍比稀释后血清或（血浆）25μl；

37℃孵育15 min，达亚美专用离心机85 r/min离心10 min 后判断结果。

8.1.2.3.4 Autovue Innova Coombs卡式法

撕掉Coombs卡上的锡箔，在每一个反应孔下做好标记；

先向每个反应柱内加入50 μl BILSS液，再分别向反应柱内加入10μl 3%A型（或B型）红细胞悬液，最后向反应柱内加入40μl患者血清或血浆；

观察柱中的反应物各组分是否混匀，必要时轻弹几下微柱，使反应物充分混匀；

37℃孵育10 min，用Biovue离心机双向离心5 min，离心必须在加样后30 min内进行；

从微柱正反两面判读并记录结果。

8.1.2.4 结果判定

通常每种方法都是以肉眼观察到最后一个（＋）的凝集作为判断的终点，终点血清（或血浆）稀释度的倒数为效价（Titer），或称滴度。

8.2 IgG类Rh血型抗体效价测定

8.2.1 IgM类Rh抗体的破坏

如果血清中同时含有IgM类Rh同型抗体,需要先将IgM类抗体破坏,操作步骤同 8.1.2.1;

8.2.2 血清（或血浆）连续倍量稀释：操作步骤同8.1.1.1；

8.2.3 IgG类Rh血型抗体效价滴定操作

8.2.3.1 经典间接抗人球法

在倍比稀释血清或血浆中加入3%对应的O型D阳性（或纯合E、纯合e、纯合C、纯合c）红细胞悬液50μl，37℃水浴30 min；

生理盐水洗涤三遍，最后一遍在吸水纸上控干，加抗IgG抗人球蛋白试剂血清1滴，血型血清学专用离心机1 000 r/min离心15 s后观察并记录结果。

8.2.3.2 凝聚胺法

在倍比稀释血清或血浆中加入3%对应的O型D阳性（或纯合E、纯合e、纯合C、纯合c）红细胞悬液50μl混匀；

各试管分别加LIM液0.65 ml，充分混合均匀后，再各加Polybrene溶液2滴，并混合均匀；

血型血清学专用离心机Ⅱ挡（1000 r/min，15 s）离心，把上清液倒掉，不要沥干，让管底残留约0.1 ml液体；

轻轻摇动试管，目测红细胞有无凝集，如无凝集，则必须重做以上步骤；

最后加入Resuspending液2滴，轻轻转动试管混合并同时观察结果。如果在30 s～1 min内凝集散开，为阴性；如凝集不散开，则为红细胞抗原抗体结合的特异性反应，需要具体判断凝集强度。

8.2.3.3 DiaMed Coombs卡式法

撕掉Coombs卡上的锡箔，在每一个反应孔下做好标记；

依次在每孔中加入0.8%的O型D阳性（或纯合E、纯合e、纯合C、纯合c）红细胞悬液50μl和稀释后血清或（血浆）25μl；

37℃孵育15 min，达亚美专用离心机85 r/min离心10 min后判断结果。

8.2.3.4 Autovue Innova Coombs卡式法

撕掉Coombs卡上的锡箔，在每一个反应孔下做好标记；

先向每个反应柱内加入50μl BILSS液，再分别向反应柱内加入10μl 3% O型D阳性（或纯合E、纯合e、纯合C、纯合c）红细胞悬液，最后向反应柱内加入40 μl患者血清或血浆；

观察柱中的反应物各组分是否混匀，必要时轻弹几下微柱，使反应物充分混匀；

37℃孵育10 min，用Biovue离心机双向离心5 min，离心必须在加样后30 min内进行；

从微柱正反两面判读并记录结果。

8.2.4 结果判定

同8.1.2.4。

8.3 检验结果的输入与确认

8.3.1 启动“检验程序”，输入用户名及口令后，进入检验程序。

8.3.2 结果的输入　单击“检验”菜单，选择“检验结果录入\修改”，通过申请序号进行检验结果的录入及修改。

8.3.3 检验结果的确认　检验结果应由实验室负责人或授权人员进行确认，方法为单击“结果处理”菜单，选择“报告确认”进入结果确认，通过选择“工作单元”、“报告日期”、“单张”或“批量”后，按“提取”键提取已经传输或录入的检验结果，按“确认”键进行确认。

9．质量控制

9.1 室内质量控制　凝聚胺法、经典抗人球蛋白法、卡式抗人球蛋白法室内质控均参照《输血相容性检测室内质量控制管理程序》进行。

9.2 室间质量评价　抗体效价测定目前尚无统一的室间质量评价活动。

10．干扰因素

IgM类抗体破坏不完全会在一定程度上影响IgG类抗体效价结果的判断。

11．结果计算及测量不确定度

不适用。

12．生物参考区间

不适用。

13．检验结果可报告区间

不适用。

14．警告/危急值

14.1 ABO血型不合时孕妇产前ABO抗体效价一般以64作为临界值，效价≥64认为可能有临床意义，需要进行动态观察抗体效价的变化，如果两次检测效价增加2倍或更多，被认为是发生新生儿溶血病的指征，应该进行更紧密的检测，以便及时采取治疗措施。

14.2 RhD血型不合时孕妇产前ABO抗体效价一般以16作为临界值，效价≥16认为有临床意义，需要进行动态观察抗体效价的变化。

15．实验室解释

孕妇体内血型抗体效价的升高提示发生新生儿溶血病的几率增大，需要进行连续动态监测。骨髓移植或干细胞移植患者移植后ABO血型抗体效价的改变可以反映供者细胞的存活、增殖情况。

16．安全性预警措施

16.1 实验室及工作人员一般安全防护措施参见《实验室安全与卫生管理程序》。

16.2 发生血液标本溢出时，应参照《实验室消毒与清洁程序》对污染的环境进行消毒处理。

16.3 操作人员发生职业暴露时，应参照《实验室职业暴露预防与处理程序》及时进行相应处理。

16.4 在仪器运转过程中，勿触及样品针、移动的传输装置等，避免造成人身伤害。禁止触摸仪器密封面板内的电路，防止造成电击损伤。

16.5 对突发传染性疾病的血液标本应启动特殊的安全防护程序。

17．变异潜在来源

不适用。

18．ABO及Rh血型抗体效价测定试验特别注意事项

18.1 在抗体倍比稀释过程中，不更换枪头，每吸完一次可用纸巾稍稍吸干。这与更换枪头的结果将不一样。

18.2 如果一种血清要分别和几种红细胞作用，要将血清做总稀释，然后分别移同样的实验容量到所需的试管中，这样会缩小误差。18.3 看结果时可能出现低稀释度的凝集强度比高稀释度的要弱，这是前带现象。18.4 对1份血清如果重复滴定，结果可能不一样，如果只有一个稀释度的差别，即前后1管之差，属正常误差范围。

18.5 测定IgG类抗体效价时，用等量巯基试剂破坏IgM类抗体时，血清已被稀释，计算效价时要加一个稀释度。

18.6 破坏后的血清倍比稀释加入相应的细胞后，立即离心肉眼观察，记录结果，然后再继续IgG抗体检测的操作，同样记录结果。

18.7 为避免不同人操作造成的一些误差，保证结果的连续性，效价测定一概用加样枪加样。

18.8 为了解抗体的效价变化而连续取样检查，最好将标本冰冻保存，以便与以后的标本进行比较对照。

19．报告时间

ABO及Rh血型抗体效价测定试验，一般于检测当日下午17点前出结果并上传HIS系统。

20．参考文献

[1] DiaMed Coombs卡、Othro Biovue Coombs卡、生理盐水、抗IgG抗体试剂

（市售单克隆）、凝聚胺试剂、2-Me试剂使用说明书．

[2] 临床输血技术规范．中华人民共和国卫生部医政司.北京，2000．

[3] 中国输血技术操作规程（血站部分）．中华人民共和国卫生部医政司．天津，

1997.