无菌检查法

无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。

无菌检查应在环境洁净度10　000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程中必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染。单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。

一、培　养　基

（一）培养基的制备

培养基可按以下处方制备，也可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。制备好的培养基应保存在2～25℃、避光的环境。培养基若保存于非密闭容器中，一般在3周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在1年内使用。

1．硫乙醇酸盐流体培养基（用于培养好氧菌、厌气菌）　酪胨（胰酶水解）15g，氯化钠2．5g，葡萄糖5g，新配制的0．1%刃天青溶液1．0ml，L－胱氨酸0．5g，硫乙醇酸钠0．5g（或硫乙醇酸0．3ml），琼脂0．75g，水1　000ml，酵母浸出粉5g。

除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解后，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH使灭菌后为7．1±0．2，分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1／2。灭菌。在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1／5，否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20min）迅速冷却，只限加热1次，并应防止被污染。

硫乙醇酸盐流体培养基置30～35℃培养。

2．改良马丁培养基（用于培养真菌）　胨5．0g，磷酸氢二钾1．0g，酵母浸出粉2．0g，硫酸镁0．5g，葡萄糖20．0g，水1　000ml。

除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH约为6．8，煮沸，加入葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH使灭菌后为6．4±0．2，分装，灭菌。

改良马丁培养基置23～28℃培养。

3．选择性培养基　按上述硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基的处方及制法，在培养基灭菌或使用前加入适量的中和剂或表面活性剂，如聚山梨酯80（用于非水溶性供试品）等。中和剂或表面活性剂的用量应通过验证。

4．营养肉汤培养基　胨10g，牛肉浸出粉3．0g，氯化钠5g，水1　000ml。

取上述成分混合，微温溶解，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，调节pH使灭菌后为7．2± 0．2，分装，灭菌。

5．营养琼脂培养基　按上述营养肉汤培养基的处方及制法，加入14．0g琼脂，调节pH使灭菌后为7．2±0．2，分装，灭菌。

6．改良马丁琼脂培养基　按改良马丁培养基的处方及制法，加入14．0g琼脂，调节pH使灭菌后为6．4±0．2，分装，灭菌。

（二）培养基的适用性检查

无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。

1．无菌性检查　每批培养基随机不少于5支（瓶），培养14d，应无菌生长。

2．灵敏度检查

（1）菌种：培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）［CMCC（B）26　003］

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）［CMCC（B）10　104］

枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）［CMCC（B）63　501］

生孢梭菌（Clostridium sporogenes）［CMCC（B）64　941］

白色念珠菌（Candida albicans）［CMCC（F）98　001］

黑曲霉（Aspergillus niger）［CMCC（F）98　003］

（2）菌液制备：接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽胞杆菌的新鲜培养物至营养肉汤或营养琼脂培养基中，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养18～24h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁培养基中，23～28℃培养24～48h；上述培养物用0．9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu（菌落形成单位）的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7d，加入3～5ml0．9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管内，用0．9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。

3．培养基接种　取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽胞杆菌、生孢梭菌各2支，另1支不接种作为空白对照，培养3d；取每管装量为9ml的改良马丁培养基5支，分别接种小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种作为空白对照，培养5d。逐日观察结果。

4．结果判断　空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管菌生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。

二、稀释液、冲洗液及其制备方法

稀释液、冲洗液配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。

1．0．1%蛋白胨水溶液　取蛋白胨1．0g，加水1　000ml，微温溶解，滤清，调节pH至7．1 ±0．2，分装，灭菌。

2．pH7．0氯化钠－蛋白胨缓冲液　取磷酸二氢钾3．56g、磷酸氢二钠7．23g、氯化钠4．30g、蛋白胨1．0g，加水1000ml，微温溶解，滤清，分装，灭菌。

如需要，可在上述稀释液或冲洗液的灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂等。

三、方法验证试验

当建立药品的无菌检查法时，应进行方法的验证，以证明所采用的方法适合于该药品的无菌检查。若药品的组分或原检验条件发生改变时，检查方法应重新验证。

验证时，按“供试品的无菌检查”的规定及下列要求进行操作。对每一对试验菌应逐一进行验证。

1．菌种及菌液制备　同培养基灵敏度检查。

（1）薄膜过滤法：将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入小于100cfu的试验菌，过滤。取出滤膜接种至硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基中，或将培养基加至滤筒内。另取一个装有同体积培养基的容器，加入等量试验菌，作为对照。按规定温度培养3～5d。各试验菌同法操作。

（2）直接接种法：取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基8管，分别接入小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽胞杆菌、生孢梭菌各2管；取符合直接接种法培养基用量要求的改良马丁培养基4管，分别接入小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管接入规定量的供试品，另1管作为对照品，按规定的温度培养3～5d。

2．结果判断　与对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则供试品的该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检查法和检查条件进行供试品的无菌检查。如含供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓慢或不生长，则供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，可采用增加冲洗量，或增加培养基的用量，或使用中和剂或更换滤膜品种等方法，消除供试品的抑菌作用，并重新进行方法验证。

方法验证试验也可与供试品的无菌检查同时进行。

四、供试品的无菌检查

1．检验数量　检验数量是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量。除另有规定外，出厂产品按表5－5规定；上市产品监督检查按表5－6、表5－7规定。表5－5、表5－6、表5－7中最少检验数量不包括阳性对照试验的供试品用量。一般情况下，供试品无菌检查若采用薄膜过滤法，应增加1／2的最小检验数量作阳性对照用；若采用直接接种法，应增加供试品1支（或瓶）作阳性对照用。

表5－5　批出厂产品最少检验数量

注：若每个容器中的装量不足接种两种培养基，那么表中的检验数量应加倍

表5－6　上市抽验样品（液体制剂）的最少检验量

注：每种培养基各接种10支供试品

表5-7　上市抽验样品（固体制剂）的最少检验量

注：每种培养基各接种10支供试品；②桶装固体原料的最少检验数量为4个包装

2．检验量　是指一次试验所用的供试品总量（g或ml）。除另有规定外，每份培养基接种供试品的量按表5－6、表5－7规定。采用直接接种法时，若每支（瓶）供试品的装量按规定足够接种2份培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基。采用薄膜过滤法时，检验量应不少于直接接种法的供试品总接种量，只要供试品特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤。

3．阳性对照　应根据供试品特性选择阳性对照菌：无抑菌作用及抗细菌的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌；抗真菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌。阳性对照试验的菌液制备同培养基灵敏度检查，加菌量小于100cfu，供试品用量同供试品无菌检查每份培养基接种的样品量。阳性对照管培养48～72h应生长良好。

4．阴性对照　供试品无菌检查时，应取相应溶剂和稀释液同法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。

无菌试验过程中，若需使用表面活性剂、灭活剂、中和剂等试剂，应证明其有效性，且对微生物生长及存活无影响。

无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法。只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法。进行供试品无菌检查时，所采用的检查方法和检验条件应与验证的方法相同。

操作时，用适宜的消毒液对供试品容器表面进行彻底消毒。如果容器内有一定的真空度，可用适宜的无菌器材（如带有除菌过滤器的针头），向供试品容器内导入无菌空气，再按无菌操作开启容器取出内容物。

5．供试品处理及接种培养基　除另有规定外，按下列方法进行。

（1）薄膜过滤法：薄膜过滤法应优先采用封闭式薄膜过滤器，也可使用一般薄膜过滤器。无菌检查用的滤膜孔径应不大于0．45μm，直径约为50mm。根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。

水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml，且总冲洗量不宜过大，以避免滤膜上的微生物受损伤。

水溶液供试品：取规定量，直接过滤，或混合至含适量稀释液的无菌容器内，混匀，立即过滤。如供试品具有抑菌作用或含防腐剂，须用适量的冲洗液冲洗滤膜，冲洗次数不得少于3次。冲洗后，如用封闭式薄膜过滤器，分别将100ml硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基加入相应的滤筒内。如采用一般薄膜过滤器，取出滤膜，将其剪成3等份，分别置于含50ml硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基的容器中，其中一份做阳性对照用。

可溶于水的固体制剂供试品：取规定量，加适宜的稀释液溶解或按标签说明复溶，然后照水溶液供试品项下的方法操作。

非水溶性制剂供试品：取规定量，直接过滤；或混合溶于含聚山梨酯80或其他适宜乳化剂的稀释液中，充分混合，立即过滤。用含0．1%～1%聚山梨酯80的冲洗液冲洗滤膜至少3次。滤膜于含或不含聚山梨酯80的培养基中培养。培养基接种照水溶液供试品项下的方法操作。

可溶于豆蔻酸异丙酯的膏剂和黏性油剂供试品：取规定量，混合至适量的无菌豆蔻酸异丙酯中，剧烈振摇，使供试品充分溶解，如果需要可适当加热，但温度不得超过44℃，趁热迅速过滤。若无法过滤，应加入不少于1　000ml的稀释液，充分振摇萃取，静置，取下层水相作为供试液过滤。过滤后滤膜冲洗及培养基接种照非水溶性制剂供试品项下的方法操作。

无菌气（喷）雾剂供试品：取规定量，将各容器置冰室冷冻约1h。以无菌操作迅速在容器上端钻一个小孔，释放抛射剂后再无菌开启容器，然后照水溶液或非水溶性制剂供试品项下的方法操作。

装有药物的注射器供试品：取规定量，装上无菌针头（非包装中所配的），若需要，可吸入稀释液或用标签所示的溶剂溶解，然后照水溶液或非水溶性制剂供试品项下的方法操作。同时应采用直接接种法进行包装中所配的无菌针头的无菌检查。

（2）直接接种法：直接接种法即每支（或瓶）供试品按规定量分别接种至各含硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基的容器中。除另有规定外，每个容器中的培养基的用量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的10%，同时，硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于15ml，改良马丁培养基每管装量不少于10ml。培养基的用量和高度同方法验证试验；每种培养基接种的管数同供试品的检验数量。

混悬液等非澄清水溶液供试品：取规定量接种至各管培养基中。

固体制剂供试品：取规定量直接接种至各管培养基中，或加入适宜的稀释液溶解，或按标签说明复溶后，取规定量接种至各管培养基中。

非水溶性制剂供试品：取规定量，混合，加入适量的聚山梨酯80或其他适宜的乳化剂及稀释剂使其乳化，接种至各管培养基中。或直接接种至聚山梨酯80或其他适宜乳化剂的各管培养基中。

6．培养及观察　上述含培养基的容器按规定的温度培养14d。培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。如在加入供试品后或在培养过程中，培养基出现混浊，培养14d后，不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养基液适量转种至同种新鲜培养基中或画线接种于斜面培养基上，细菌培养2d、真菌培养3d，观察接种的同种新鲜培养基是否再出现混浊或斜面是否有菌生长；或取培养液涂片，染色，镜检，判断是否有菌。

五、结果判断

若供试品均澄清，或虽显混浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定；若供试品管中任何一管显混浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定，除非能充分证明试验结果无效，即生长的微生物非供试品所含。当符合下列至少一个条件时，方可判试验结果无效：

（1）无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求；

（2）回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素；

（3）阴性对照管有菌生长；

（4）供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。

试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法重试，若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌生长，判供试品不符合规定。