神经肽的释放

科学家们对于突触前特异化部位的快速递质释放、释放的时间顺序以及参与的分子，已经有了相当清楚的了解。回头看看神经肽，多数神经肽从非突触部位释放，与快速神经递质的释放相比较，它受到的关心较少。神经肽从DCV释放，可能需要调节小泡运输和释放的独特蛋白质。树突的神经肽释放是一个特点，它的生理学意义和机制都是值得很好关心的。

哺乳动物神经肽的释放，在神经垂体里面得到了非常彻底的研究。在那里，轴突发源于下丘脑大细胞分泌神经元，即室旁核（PVH）和视上核的神经元，它们的轴突汇聚起来，在神经垂体释放加压素（VP）和催产素（OT），进入循环系统。VP在调节水的稳态方面起关键作用，对于水分子在肾脏里的重吸起重要作用；而OT的作用是在母体授乳时诱发乳汁的释放［9］。

神经垂体提供了神经肽释放研究的良好模型，因为神经垂体含有高密度的轴突末梢，末梢内充满了大致密轴心神经分泌小泡，直径180～200 nm。这种标本提供相对大量的、可以检测到的肽释放。神经垂体的经典实验显示，每个锋电位到来时肽就释放，当锋电位频率增高时其释放量会增高达一定水平。如果锋电位爆发后随之以一段时间的沉默，这种模式对于增强OT或VP的释放特别有效。有报道指出，当锋电位爆发时，轴突末梢胞质的钙增高，这可能是增强DCV胞外排之关键［9］。

虽然神经垂体提供了有用的模型来研究神经肽释放，但是粗的神经垂体神经末梢的释放，与另一种更常见的细轴突末梢的释放，两者之间存在重要的差别：前者的末梢充满了大的神经分泌颗粒，后者可能含有中等大小的（100 nm）含神经肽的DCV。大的DCV估计含有60000～85000个分子的OT或VP，而多数神经元的中等大小DCV，其体积约为大DCV的1/8，提示它的肽含量相应较少（图6-11）。多数释放神经肽的轴突含有少数几个DCV，而且其定位并不优先靠近突触前特异化，这点与含有谷氨酸和GABA的清亮小泡是不同的，后者聚集在突触特异化的活动带附近（图6-11、图6-12）。小清亮小泡充灌氨基酸递质的方式是通过膜的小泡转运蛋白，而且就在局部轴突的终扣上进行；但是神经肽不同，它在粗面内质网中合成，并从内质网转运进入DCV，而DCV是在细胞体的高尔基器上产生的。所以，DCV一定要经过轴突内运输，运送到释放位点，而此位点离开细胞体有一定的距离。在多数神经元的轴突末梢里面仅有相对少量的DCV，此事实提示，中枢神经系统终扣的神经肽释放，若与神经垂体的释放相比，其受空间、时间的约束程度是不同的，中枢神经系统单个终扣的少量DCV实现胞裂外排以后，至少要经过几个小时才能得到重新补充［9］。

图6-11　两根轴突与大细胞分泌神经元形成对称性突触接触

突触前轴突含有少数几个致密轴心小泡（DCV，短箭头），还有几个突触小清亮小泡（SV）。在突触后神经元上有大致密轴心小泡（Large DCV，LDCV；用长箭头表示）。图宽4 μm。（图引自［9］）

图6-12　快速氨基酸突触传递（左）与慢的神经肽传递（右）之比较（彩图见图版此处）图引自［9］。

无脊椎动物神经元被证明对于研究小泡的运输和释放是有用的。最近有关无脊椎动物神经元的成像研究结果提示，含有神经肽DCV的运输，看起来是以一种效力很低的方式进行的。在细胞体和远端轴突终末之间，这种DCV一会儿往前走，一会儿又回去。它们在微管上沿着前进的方向行走，所用的运动蛋白是驱动蛋白-3，然后转换到动力蛋白，沿逆向回到轴突始段，在那里变过方向再向外走。每运输一批DCV，仅少数几个DCV可以走到突触终扣，因此运输效率很低。在哺乳动物的离体三叉神经节神经元中，刺激神经元可以减少DCV向前传导的速度，并增加它的停顿时间。由pH荧光素测定发现，DCV膜的融合与释放在整个轴突的全长、在轴突的生长锥都可以发生［9］。

当看到含肽免疫反应性的轴突显然接触到另外一个细胞时，经常发生的问题是：此轴突是否与它的伴侣形成突触？从理论上讲，这种安排增加了释放肽的潜在有效性；但此现象也可能是无关的，因为经常看到，肽是在非突触部位释放的，而且一般要弥散数微米来激活邻近的细胞［9］。

为什么研究肽的释放比较困难？因为我们现在关于快速递质释放所知道的，都来自递质释放的电生理学反应。不论谷氨酸还是GABA都可以在突触后特异点产生毫秒级别的非常快速的反应，可以容易地检测到突触后神经元上电位或电流的偏移，即EPSP和IPSP。与快速作用的氨基酸递质不同，中枢神经系统单个终扣释放的神经肽的量可能很少，而且更重要的是，接受神经肽的细胞反应相对比较慢，其时间为几秒到几分钟，难以与低肽的释放反应关联起来，不像前面测定EPSP和IPSP那样只有几毫秒。因此对肽来讲，难以做到对单个或多个胞外排事件进行量子分析。此外，谷氨酸和GABA所介导的突触事件，其上升时间是相对快速的，个别的事件可以被分离开来。而与此成对比，神经肽浓度的上升时间相当慢。最后，单个锋电位可以释放GABA或谷氨酸，但是神经肽的释放可能需要高水平的神经活性，这就使得研究刺激-反应关系有某些进一步的困难。在神经垂体内游离的大细胞分泌神经元末梢中，在分离的大细胞分泌神经元胞体上，电容测量记录方法都被证明对研究大致密轴心小泡（LDCV）的融合和小清亮小泡的融合有用（图6-12）［9］。

采用基因工程方法，肽可以被荧光报告物标记，在显微镜下观察，但需要有适当的对照用来保证这个报告物并不改变肽的运输和释放。对于快速递质释放曾经用亲脂性染料进行了研究，例如FM1-43，这种方法检测小泡融合时染料的内化。还有几种有趣的基因编码物质如pH荧光素，它是一种具有pH敏感性的GFP蛋白变种。荧光素方法对于研究中枢神经系统终扣的肽释放，应用仍然有限［9］。

研究哺乳动物中枢神经系统的一个比较看好的方法是应用无脊椎动物神经肽——FMRF酰胺。此肽有一个特点，能直接打开离子通道导致钠内流，而不需要G蛋白的耦合。可以把FMRF酰胺和它的受体表达于哺乳动物细胞，然后来研究释放肽的快速反应。这种方法曾被用来研究内分泌细胞如何释放神经肽，如胰岛β细胞及肾上腺嗜铬细胞。在嗜铬细胞上，神经肽和儿茶酚胺共同释放，且来自单个小泡［9］。

神经肽释放研究中的另一个问题是，神经肽是组成型释放，即一直在释放，还是激活以后受调节释放。组成型释放可导致受体脱敏，反应降低，或者可以导致受体慢性激活。对脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）的研究发现，BDNF有快释放和慢释放两种形式，可以有不同的反应。BDNF的急性激活是作用于酪氨酸受体激酶（tyrosine receptor kinase B，TRKB），导致发育中海马神经元的神经突起伸长；持续激活则可能触发神经突起的分叉。这两种类型的释放也可以区别性地调节两种不同蛋白质的表达——Homer1和Arc［9］。

神经肽可以在神经元的胞体-树突复合体处进行局部释放。在进行超微结构分析时，膜的融合释放图像上有无Ω样剖像（profile）是一个有用的指标。在固定的哺乳动物视上核组织里，经过高钾或钙离子通透蛋白A23187刺激后，实验结果提示，神经肽胞外排的证据偶然可以在突触前及突触周围膜上看到。然而更常见的是，与突触特异化无关，胞外排可以在胞体-树突、轴突终扣及轴突干等处发现。下丘脑视上核神经分泌细胞提供了一个模式系统，可以用来研究树突释放（图6-13）。此模式支持高浓度、高水平的神经肽合成。大细胞分泌神经元树突存在着大量含肽的LDCV。对这些结果进行解释的关键是，大细胞分泌神经元的局部轴突末梢上没有DCV。大细胞分泌神经元的轴突投射主要是到神经垂体，这是非突触性末梢。室旁核（PVN）而不是视上核，它的小细胞分泌神经元也合成OT与VP，从这些小细胞分泌神经元发出的轴突并不靶向到神经垂体。相反，它们与中枢神经系统的神经元发生突触接触，可以投射到脑的其他部位和投射到脊髓［9］。

图6-13　显示下丘脑视上核催产素神经元的显微切片图

图的宽度为900 μm。（图引自［9］）

一般而言，增加动作电位频率就能够增加神经肽从轴突及树突的释放。钙离子对于氨基酸递质的快速释放是必要的，对于肽也是如此；但是肽释放需要更高的胞质钙浓度，也很可能需要更高的神经元活性。当氨基酸递质分泌的时候，膜电位去极化激活电压门控钙通道，导致钙通过质膜内流，发动突触小泡的释放。有几方面的证据提示，有一种很巧妙的可能性就是，在某些条件下，树突释放可以不依赖于轴突释放的形式，其部分原因是，释放上的差别与轴突和树突存在不同的通道有关。例如，强啡肽从海马树突和轴突释放，依赖于不同的钙通道。树突的强啡肽释放是通过激活L型钙通道，但轴突释放与此无关。去极化介导的视上核神经元树突的催产素（OT）释放，主要依赖于N型钙通道，较少依赖于P/Q型钙通道，其他类型的钙通道在成熟的OT神经元中不起什么作用。与此相平行，钙通道不依赖的机制在轴突和胞体中也有所不同。在OT细胞胞体的钙调节肽释放中，内质网起一定作用，但是内质网在轴突末梢的OT释放中似乎不起重要作用。在另一些系统中发现了轴突末梢和胞体的区别，例如钙减少的机制可以有所不同，包括线粒体、质膜钙泵以及钠/钙交换蛋白。最后，大细胞分泌神经元共同释放的ATP，在轴突末梢和细胞体上产生不同的反馈效应，可以差别性地调节肽的释放，部分由于轴突和细胞体上有不同的ATP受体存在［9］。

钙也可以从细胞内储库特别是内质网进入胞质。OT或药物毒胡萝卜素可引起钙从细胞内储库进入胞质，直接诱发树突的OT或VP释放，而不依赖于动作电位。细胞内的钙释放也可以预处理此释放系统，为随之而来由电活动所引起的释放做准备。OT受体的激活诱导了磷脂酶C，结果产生三磷酸肌醇（inositol trisphosphate，IP3），以后又引起钙从内质网释放。这种预处理增强了以后的OT释放，其原理可能是靠肌动蛋白依赖的、含肽小颗粒的运动，使之朝向质膜。OT负荷DCV的预处理，部分地是通过DCV的运动，使DCV到达比较接近质膜的位置。这对以后电刺激的到来，也在一定程度上起到了OT释放的放大作用。有意思的是，用毒胡萝卜素预处理，可以增加钾介导去极化诱导的OT释放，其时间可长达90 min。除了脑细胞，对其他细胞的预处理DCV的释放也有研究，特别是合成黄体生成素的垂体细胞。视前区神经元轴突支配正中隆起，释放GnRH进入门脉血液循环，此GnRH可以对垂体细胞分泌黄体生成素起到预处理作用。这种细胞分泌有多个机制，显示了对此后的GnRH刺激有更强的释放［9］。

参与树突和轴突末梢胞外排的蛋白质表达的差别，也可以解释释放的差别。神经垂体的大细胞分泌神经元轴突末梢有3个蛋白质——VAMP-2、SNAP-25和突触融合蛋白-1。实验发现，这三者靠近含有OT和VP的DCV。与此不同，虽然同样是含有突触融合蛋白-1细胞类型的树突，但VAMP-2、SNAP-25和突触结合蛋白-1与OT和VP并不共定位。神经肽的合成一般在胞体发生，但有人报告，在树突也有合成。树突合成的神经调质BDNF，被认为在皮层树突棘的发育中起关键性作用，而且在下丘脑神经元上对瘦素起反应，当调节能量的内稳态时起作用［9］。

树突释放的神经肽起什么作用？最有可能的是，神经肽作为一个信号作用于邻近神经元，使之增加或减少活性。在嗅球处，多数神经元都具有树突，包括僧帽神经元、丝球周围神经元、颗粒细胞等。在突触前特异化部位，树突释放GABA或谷氨酸，许多突触前树突组构成为交互作用模式。例如，僧帽细胞的树突释放谷氨酸，它激活颗粒细胞树突的突触前成分，颗粒细胞的突触前成分又释放GABA作用于僧帽细胞，形成反馈抑制。与此不同，脑内多数树突并不对其他细胞的突触前成分起作用，树突释放肽似乎并不依赖于突触特异化。以非突触性方式释放的OT或VP的可能作用是募集或抑制邻近的细胞，或者使细胞间的活动同步化。OT神经元上有OT受体的表达，VP细胞上面有加压素受体（VP受体：vasopressin receptor，VPR）的表达。在泌乳的时候，OT释放以一种协调的爆发性形式发生。在此情况下，在短暂时间大约1 s内，多个OT神经元快速放电。这种间断性的、爆发性的OT释放，可以防止乳腺上OT受体的去敏感化。如果OT的浓度水平保持在持续高水平上，受体会去敏感化；而现在OT的分泌是爆发性的，所以避免了去敏感化。OT的爆发性释放有可能依赖于树突释放OT，树突释放预处理了邻近细胞，使得以后有大量的OT可以从轴突释放。那是依赖于锋电位增多的，如前所述［9］。

树突释放肽可以发动逆向信号到胞体，从而调制以后局部轴突氨基酸类递质的快速释放。大细胞分泌神经元胞体和树突所释放的OT，可以减少突触前谷氨酸和GABA的释放。开始时人们认为，这种情况是由突触前肽受体介导的。现在看来，有可能是释放的OT激活了OT细胞上的OT受体，导致内源性花生四烯酸释放增加，花生四烯酸以逆向弥散方式激活突触前轴突的大麻素受体1（cannabinoid receptor 1，CB1R；也称CB1受体），从而减少快速递质的释放。此逆向作用是由CB1受体介导的。为了达到突触前抑制，当OT神经元去极化以后，OT的释放似乎是必需的。短暂阻断突触活性，可以把OT细胞从周围游离出来，可能是由于放大了局部的细胞相互作用。在这里，调制性的肽激活了内源性大麻素的分泌，树突的释放抑制了邻近的突触前轴突。一个关键性的特征是内源性大麻素的调制；在许多脑区里的情况是，内源性大麻素从突触后神经元释放并逆向弥散，调制突触前轴突的快速递质。例如GABA或谷氨酸的释放，时间可以是短的或是长而持久的，其机制是降低突触前的钙而增加突触前的钾电导，或者直接抑制小泡融合。在VP神经元中，去极化诱导的内源性大麻素释放通过钙依赖的机制也减弱了突触前的GABA活性。此外，诱发的VP释放减少了IPSC频率，这是由于另一个内源性大麻素不依赖的机制［9］。

视前区/隔区神经元合成GnRH，这些神经元的树突能释放肽，通过它协调其他邻近GnRH神经元的活动。对灵长类胚胎GnRH神经元的研究发现，当神经元活动增加时，胞体-树突的FM1-43标记增加，这提示FM1-43与GnRH免疫反应性是共定位的。今后，若能用成像方法进一步证实成熟活体GnRH神经元的胞体-树突释放，将能更进一步支持以上看法［9］。