茶叶中茶多酚及儿茶素含量的测定

1. 茶叶中茶多酚(tea polyphenol)含量的测定(GB/T8313—2008)

1)原理

茶叶磨碎样中的茶多酚用70%的甲醇在70℃水浴上提取，福林酚(Folin-Ciocalteu)试剂氧化茶多酚中的—OH基团并显蓝色，最大吸收波长为765nm，用没食子酸(gallic acid)作校正标准定量茶多酚。

2)仪器

①分析天平: 感量0.001g;

②离心机;

③分光光度计。

3)试剂

①乙腈: 色谱纯;

②甲醇;

③福林酚(Folin-Ciocalteu)试剂;

④7.5%Na2CO3: 称取37.50g±0.01g Na2CO3，加适量水溶解，转移至500m L容量瓶中，定容至刻度，摇匀，室温下可保持1个月。

⑤没食子酸标准储备溶液(1000μg/m L): 称取0.110±0.001g没食子酸(相对分子质量188.14)，于100m L容量瓶中溶解并定容至刻度，摇匀。

⑥没食子酸工作液: 用移液管分别移取1.0m L，2.0m L，3.0m L，4.0m L，5.0m L的没食子酸标准储备溶液于100 m L容量瓶中，分别用水定容至刻度，摇匀，浓度分别为10μg/m L，20μg/m L，30μg/m L，40μg/m L，50μg/m L。

4)操作步骤

(1)样品溶液的制备

①母液的制备: 称取0.2000g均匀磨碎的试样，于10m L离心管中，加入在70℃中预热过的70%甲醇溶液5m L，用玻璃棒充分搅拌均匀润湿，立即移入70℃水浴中，浸提10min (隔5min搅拌一次)，浸提后冷却至室温，转入离心机，在3500r/min转速下离心10min，将上清液转移至10m L容量瓶。残渣再用5m L的70%甲醇溶液提取一次，重复以上操作。合并提取液定容至10m L，摇匀，过0.45μm膜，待用(该提取液在4℃下可至多保存24h)。

②测试液: 移取母液1.0m L于100m L容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，待测。

(2)标准曲线的绘制

用移液管分别移取没食子酸工作液各1.0m L于刻度管中，在每个试管内分别加入5.0 m L10%的福林酚试剂，摇匀。反应3～8min内，加入4.0m L7.5%Na2CO3溶液，加水定容至刻度，摇匀。室温下放置60min。用1cm比色皿，以蒸馏水作空白，在765nm波长处测定吸光度，按没食子酸工作液的浓度与吸光度绘制标准曲线。

(3)样品的测定

取测试液1.0m L按照上述操作测定吸光度，根据标准曲线计算样品液浓度。

5)结果计算

式中: X——茶多酚的含量，mg/g;

C——由标准曲线或回归方程得到的没食子酸浓度，μg/m L;

V——样品提取液的体积，10m L;

d——稀释倍数，1m L稀释成100m L，稀释倍数为100;

m——样品的质量，g。

6)说明及注意事项

样品吸光度应在没食子酸标准工作曲线的校准范围内，若样品吸光度高于50μg/m L浓度的没食子酸标准工作溶液的吸光度，应重新配制高浓度没食子酸标准液进行校准。

2.儿茶素(catechins)含量的测定(GB/T8313—2008)

1)原理

样品烘干、磨碎，用70%的甲醇溶液在70℃水浴上提取，儿茶素的测定用C18柱，检测波长278nm，梯度洗脱，HPLC分析，用儿茶素类标准物质外标法直接定量，也可用儿茶素类与咖啡碱的相对校正因子RRFStd(ISO国际换算结果)来定量。

2)仪器

①分析天平: 感量0.0001g;

②离心机;

③高效液相色谱仪: 包含梯度洗脱及检测器;

④液相色谱柱: C18(内径5μm，250mm×4.6mm);

⑤水浴锅。

3)试剂

①乙腈: 色谱纯。

②乙二胺四乙酸(EDTA)溶液: 10mg/m L(现配)。

③抗坏血酸溶液: 10mg/m L(现配)。

④甲醇、乙酸等。

⑤稳定溶液: 分别将25m LEDTA溶液、25m L抗坏血酸溶液、50m L乙腈加入500m L容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀。

⑥色谱流动相。

流动相A: 分别将90m L乙腈、20m L乙酸、2m LEDTA加入1000m L容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，溶液过0.45μm膜。

流动相B: 分别将800m L乙腈、20m L乙酸、2m LEDTA加入1000m L容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，溶液过0.45μm膜。

⑦标准储备溶液。

咖啡碱储备溶液: 2.00mg/m L。

没食子酸储备溶液: 0.100mg/m L。

儿茶素类储备溶液: 儿茶素( +C) 1.00mg/m L、表儿茶素( +EC)1.00mg/m L、表没食子儿茶素( +EGC)2.00mg/m L、表没食子儿茶素没食子酸酯( +EGCG)2.00mg/m L、表儿茶素没食子酸酯( +ECG) 2.00mg/m L。

⑧标准工作溶液: 用稳定液配制。

标准工作溶液的浓度: 没食子酸5～25μg/m L，咖啡碱50～150μg/m L，+C50～150 μg/m L，+EC50～150 μg/m L，+EGC100～300 μg/m L，+EGCG100～400 μg/m L，+ECG50～200μg/m L。

4)操作步骤

(1)样品溶液制备

①母液的制备: 按照茶多酚含量测定操作步骤中母液的制备进行。

②测试液: 用移液管移取母液2m L至10m L容量瓶中，用稳定溶液定容至刻度，摇匀，过0.45μm膜，待测。

(2)色谱条件

流动相流速: 1m L/min;

柱温: 35℃;

紫外检测器: λ=278nm;

梯度条件: 100%A相保持10min→(15min内由100%A相→68%A相、32%B相)→68%A相、32%B相保持10min→100%A相。

(3)测定

待流速和柱温稳定后，进行空白运行。准确吸取10μL混合标准系列工作液注射入HPLC，在相同的色谱条件下注射10μL测试液，测试液以峰面积定量。

5)结果计算

(1)计算方法

①以儿茶素类标准物质定量:

式中: A——所测样品中被测成分的峰面积;

f Std——所测成分的校正因子(浓度/峰面积，浓度单位“μg/m L”);

V——样品提取液的体积，m L;

d——稀释倍数;

m——样品的称取量，g。

②以咖啡碱(caffeine)标准物质定量:

式中: RRFStd——所测成分相对于咖啡碱的校正因子;

SCaf——咖啡碱标准曲线的斜率(峰面积/浓度，浓度单位“μg/m L”)。

表13－2 儿茶素类相对咖啡碱的校正因子表

(2)儿茶素类总量计算公式

儿茶素类总量(%) =EGC含量+C含量+EC含量+EGCG含量+ECG含量