－酚试剂法

目前实验室较多用Folin-酚法(又名Lowry法)测定蛋白质含量，此法的特点是灵敏度高，较双缩脲高2个数量级，较紫外法略高，操作稍微麻烦，反应约15分钟有最大显色，并最少可稳定几个小时，其不足之处是干扰因素较多，有较多种类的物质都会影响测定结果的准确性。

1. 原理

蛋白质中含有酚羟基的酪氨酸，可与酚试剂中的磷钼钨酸作用产生蓝色化合物，颜色深浅与蛋白含量成正比。

2. 试剂和材料

①碱性铜溶液: 甲液: Na2CO32g溶于0.1mol/L的100m LNa OH溶液中。乙液: Cu SO4 ·5H2O0.5g溶于1%酒石酸钾100m L中。临用前，取甲液50m L，乙液1m L混合。

②酚试剂: 取钨酸钠(Na2WO4·2H2O) 100g和钼酸钠(Na2Mo O3·2H2O) 25g，溶于蒸馏水700m L中，再加85%H3PO4，50m L和HCl(浓)100m L，将上物混合后，置1500m L圆底烧瓶中温和地回流10小时再加硫酸锂(Li2SO4·H2O)150g，水50m L及溴水数滴，继续沸腾15分钟以除去剩余的溴，冷却后稀释至1000m L，然后过滤，溶液应呈黄色(如带绿色者不能用)，置于棕色瓶中保存。使用标准Na OH溶液滴定，以酚酞为指示液，而后稀释约一倍，使最后浓度为1mol/L。

③蛋白标准溶液(0.1mg/m L): 准确称取10mg牛血清蛋白，在100m L容量瓶中加生理盐水至刻度。溶解后分装，放于-20℃冰箱保存。

3. 分析步骤

1)标准曲线的制备

按表9-1操作，在试管中分别加入0m L，0.2m L，0.4m L，0.6m L，0.8m L，1m L蛋白标准溶液，用生理盐水补足到1m L。加入5m L的碱性铜试剂，混匀后室温放置20分钟后，再加入0.5m L酚试剂混匀。

30min后，以第1管为空白，在波长650nm比色，读出吸光度，以各管的标准蛋白浓度为横坐标，以其吸光度为纵坐标绘出标准曲线。

2)样品蛋白质测定

准确吸取1m L蛋白质溶液，加入测定管，再以标准蛋白溶液作为阳性对照(标准管)，以Na Cl溶液作为阴性对照(空白管)，按表9-2操作:

表9－1 Folin－酚法标准曲线试剂的添加量

表9－2 Folin－酚法蛋白测定中试剂的添加量

混匀各管，30min后，在波长650nm比色，读取吸光度。

4. 分析结果的表述

以测定管读数查找标准曲线求得样品蛋白含量。

5. 说明与注意事项

①Tris缓冲液、蔗糖、硫酸铵、酚类、柠檬酸以及高浓度的尿素、胍、硫酸钠、三氯乙酸、乙醇、丙酮等均会干扰Folin-酚反应。

②当酚试剂加入后，应迅速摇匀(加一管摇一管)以免出现浑浊。

③由于这种呈色化合物组成尚未确立，它在可见光红外光区呈现较宽吸收峰区。不同实验室选用不同波长，有选用500或540nm，有选用640nm，700或750nm。选用较高波长，样品呈现较大的光吸收，本实验选用波长650nm。