共聚焦成像的光学原理

共聚焦显微镜是一个集成光学显微镜系统，它是由荧光显微镜、激光点光源、具有光学和电子装置的扫描头、计算机、显示监视器和图像获取、处理和分析的软件所组成。

扫描头产生光子信号，由此重构共聚焦图像。它含有以下装置：外置一个（或多个）激光源、荧光滤片组件、电流计为基的光栅扫描机构、产生共聚焦图像的一个（或多个）可变针孔光阑和用于探测不同荧光波长的光电倍增管（photomultiplier tube，PMT）探测器。

扫描头中各个组件的布置如图6-1所示。计算机把光电倍增管的电压波动转换成数字信号从而在计算机监视器上显示图像。共聚焦显微镜的光学原理可用图6-2来加以说明。

（1）在金相显微镜和生物显微镜中均采用上照明，即照明光源和探测器都在样品的同一侧，并且被物镜所分离，此时，物镜也兼有聚光镜的功能。

（2）荧光滤片组件（激发滤片，双色滤片，发射滤片）的作用是和它们在大视野荧光显微镜（生物显微镜的一种）中的作用是相同的，主要用于生物医学样品。所谓荧光就是物质吸收较短波长（能量较高）的光线后，把光源的能量转化为波长较长的可见光。激发滤片让比荧光波长短的光束透过，由此激发生物样品特殊波长的荧光。双色滤片（双色镜）反射短波光，让长波光通过双色滤片。发射滤片使样品中产生的荧光透过，消除激发的残留短波长，荧光波长在眼睛或照相机中成像。

（3）共聚焦光学的核心就是针孔光阑，它接受正聚焦激光逐点光栅扫描产生荧光光子，极大地阻挡了来自样品上、下聚焦面（失焦面）的荧光信号，仅有极小部分失焦面信号通过针孔。图6-2显示出针孔消除失焦面信号的原理。在共聚焦显微镜中，点的光栅扫描和针孔同时使用（作为空间滤片），两者结合并分别处于物镜的共轭面（物平面和像平面）上，这是产生共聚焦图像的基础。

图6-1 扫描头中各个组件的布置

图6-2 共聚焦显微镜的光学原理

（4）在任何时间（t），从样品激发点产生的荧光波长均被物镜接收并被聚焦在像平面上的针孔内，针孔内的荧光光子随后被光电倍增器（PMT）接受。由于针孔是与样品平面共轭的，而PMT与样品平面不共轭，因此PMT看不到图像，但可接收到不同时间产生的光子束流，并将之转变成电压信号，计算机将电压信号数字化并在监视器上显示信号。

（5）为了产生样品的大视域图像，在共聚焦显微镜中使用激光逐点光栅扫描的方式。这种光栅扫描方式是通过电流计马达（galvanometer motor）驱动的两个高速振动镜（high-speed vibrating mirrors）实现的。一个镜左右振动，另一个镜上下振动。在整个扫描时间内样品上不同位置激发的聚焦点强度变化均在针孔中被实时记录下来。

（6）PMT探测器将针孔内的光子强度连续地转变为电压（模拟信号）。模拟信号在规则的间隔时间内通过模数转换器转变为像素（数字图像元素）并被储存和在计算机监视器上显示出来。由于物体的共聚焦图像是通过光子信号被重构出来的，最终被计算机显示出来，因此，共聚焦图像不是作为真正图像存在，它在显微镜中不能被眼睛所观察到。