一、目的要求
掌握差速离心法分离植物线粒体的技术及其应用。
二、实验原理
利用沉降系数不同的颗粒，在一定介质中沉降速度的差异，采取分级差速离心的方法，将线粒体从细胞悬液中逐级分离出来。离心用的悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近于细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在p H7.4的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。
三、仪器与试剂
1．材料
玉米黄化幼苗。
2．主要试剂和仪器
分离介质：0.25 mol/L蔗糖、50 mmol/L的Tris-HCl缓冲液（p H7.4）、3 mmol/L EDTA、0.75 mg/m L牛血清白蛋白（BSA）；0.3 mol/L甘露醇（p H7.4）、20%次氯酸钠（Na Cl O）溶液、1%詹纳斯绿B染液、生理盐水。
温箱、冰箱、冷冻控温高速离心机、显微镜、电热恒温水浴锅（图1-2-1）、解剖盘、剪刀、镊子、双面刀片、载玻片、盖玻片、漏斗、小烧杯、表面皿、吸管、吸水纸、纱布。
图1-2-1 电热恒温水浴锅
四、实验操作与步骤
（1）玉米种子用20% Na Cl O溶液浸泡10 min消毒，清水冲洗30 min，再浸泡清水15 h。将种子平铺在放有湿纱布的盘内，保持湿度，置温箱 28℃于暗处培育 2～3 d。待芽长到1～2 cm长时剪下约15 g，放置0℃～4℃冰箱1 h。
（2）加3倍体积分离介质，在瓷研钵内快速研磨成匀浆。
（3）用多层纱布过滤，滤液经700 g离心10 min。除去细胞核和细胞碎片沉淀。
（4）取上清液10 000 g离心10 min，沉淀为线粒体。再同上离心洗涤一次。
（5）沉淀为线粒体，可存于0.3 mol/L甘露醇中，注意以上匀浆化及离心均控制在0℃～ 4℃进行。
（6）线粒体的检测：取线粒体沉淀涂在清洁的载玻片上，立即滴加1%詹纳斯绿B染液染色20 min，放上盖玻片，用显微镜观察，线粒体是蓝绿色圆形颗粒。
五、实验说明
整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。
六、思考题
1．玉米黄化幼苗的制备条件对线粒体的制备有无影响？
2．细胞核与线粒体的分离除了差速离心以外，还有哪些方法能够进行分离？
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