1.6.1 微卫星标记的开发费时，成本较高，效率较低
微卫星标记最大的短处就是在着手研究某生物种群之前，必须首先开发其微卫星标记。检测微卫星的多态性，需要设计引物，用PCR 扩增含重复序列的区域。引物的长度虽然仅有20 bp左右，但要获得特异性强、扩增效率高的引物，微卫星侧翼区的碱基序列必须满足若干条件。因此，为设计引物往往需要知道包含微卫星部分在内的数百碱基的连续序列。蟹类等海洋生物微卫星标记开发，需要按照DNA抽提、文库构建、筛选、测序、引物设计的步骤开发微卫星标记。这个过程往往至少需要1～2个月，与RAPD和AFLP标记开发相比花费时间多。此外，文库构建、测序、引物合成等必须的步骤也大大提高了开发微卫星标记的成本。在邓杰内斯蟹（Pamela et al，2004）的微卫星分离中，对436个含有插入序列的克隆进行筛选，仅开发出6对微卫星引物。所获得的有用引物仅占阳性克隆种数的1.38%。由此可见，微卫星的开发效率相对较低。
1.6.2 无效等位基因（null allele）的存在
一般来说，微卫星是中性标记，遵循孟德尔遗传定律，即等位基因独立分离且自由组合。但如果在家系中有无效等位基因存在，则能够导致个体的基因型与经典的孟德尔遗传明显不一致（Callen et al，1993）。无效等位基因是指不被PCR 扩增的等位基因，常常是由引物结合部位的点突变、插入或缺失引起（Pemberton et al，1995）。因此，微卫星标记在用于种群或家系研究之前需要验证其是否符合孟德尔遗传。
1.6.3 “结巴”带（stutter bands）
在用变性聚丙酰胺凝胶检测微卫星位点的PCR 扩增产物时，有时1个等位基因不是1条带，而是由1个主带和数条附加带组成，这些附加带称作“结巴”带或“阴影”带（shadow bands）。“结巴”带大多出现在重复单位为2 碱基的微卫星位点，并且通常比主带（长度n）短数个重复单位（n22，n24，…），强度随着离主带距离的加大而减弱，出现几率则随重复次数的增多而增大（Murray et al，1993）。青蟹（沙
）（Gopurenko et al，2002）3个微卫星位点（Ss513，Ss403和Ss112）能产生非常微弱的“结巴”带，但是剩余的2条带（Ss101 和Ss103）产生的“结巴”带却很明显。
1.6.4 上游等位基因扩增丢失（upper allele drop out）
上游等位基因扩增丢失是指，当等位基因的大小存在差异时，较大的等位基因在杂合体中无法检测到。邓杰内斯蟹2个位点，Cma2和Cma4，具有较宽的等位基因大小变化范围，比预期的孟德尔遗传平衡显示出更少的杂合性。但是，通过多次检测并纠正反应的误差发现，只有位点Cma4极显著地背离孟德尔遗传平衡。在一些样品中，用Cma2和Cma42个位点对外观上的纯合体进行重复性的扩增，产生另一个片段较大、条带较弱的扩增等位基因片段，揭示出杂合度缺失的趋势有可能是这些位点某些上游等位基因扩增丢失造成的。
1.6.5 展望
微卫星作为一种新型DNA标记，具有密度大、多态性丰富、高度杂合、稳定性好、遵循孟德尔分离定律、共显性遗传、易于PCR扩增等特点，已成为遗传学、生态学和进化研究的有力工具。针对微卫星存在的问题和不足，可以通过实验技术理论和方法的创新不断加以改进。蟹类的种类很多，目前仅在小部分蟹类中有微卫星分离的报道，微卫星标记在蟹类遗传学研究中的应用还处于初级阶段。但随着研究方法和手段的不断改进，再加上新的蟹类微卫星标记的不断发现，蟹类微卫星标记在遗传学中的研究将日益加强。蟹类染色体数目较多，将会对其遗传图谱的构建和QTL定位等方面的研究带来挑战。不过，相信随着蟹类分子遗传学研究和分子生物学技术的飞速发展，微卫星技术在蟹类种群遗传、品系亲缘关系分析、家系分析、亲子鉴定、个体识别、遗传图谱构建、基因连锁分析、QTL解析、引入种类遗传影响评价、遗传多样性保护等研究领域的应用将更加广泛而深入。
（作者：刘萍，宋来鹏，李健，刘振辉）
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