实验前的准备
微生物学实验是生物类专业的必修实验课，通过该课程的教学可使学生完整、全面地了解和掌握微生物学的基本理论和研究方法，使学生得到有关微生物实验技能的基本训练，进一步加深对微生物基础理论的理解，并力求达到系统地培养学生分析问题、解决问题和实际动手能力，在实验中进一步提高学生的科学素质修养。
为了上好微生物学实验课，并保证安全，特提出如下注意事项：
每次上课前，必须认真阅读实验指导，明确该次实验的目的要求、实验原理和注意事项，熟悉实验内容、方法和步骤，做到心中有数，思路清晰。
1．进入实验室需穿着工作服、包覆式鞋子（严禁穿拖鞋、凉鞋）。实验期间（特别是用火时），蓄长发的学生应将长发扎起于脑后。个人物品请勿放置于实验桌上，实验期间随时保持桌面整洁。
2．实验室内应保持安静和整洁，勿高声谈话和随便走动，严禁吸烟和食用任何食品饮料。注意并熟悉医药箱、灭火器的存放位置，并熟知其使用方法。
3．实验时应仔细认真，严格按操作规程进行，注意改变生活中的习惯动作，以掌握微生物学实验的科学操作方法。认真及时做好实验记录，对于当时不能得到结果而需要连续观察的实验，则需记下每次观察的现象和结果，以便分析。
4．使用贵重仪器应先事先熟知操作规程，遇仪器故障时请教师帮助解决。
5．使用药品时，应确实了解药品的物性、化性、毒性及正确使用方法，并且对实验过程中可能发生的危险，采取适当的预防措施。实验药品宜采用少量称取方式，若是不慎采取过量，可倒入特定回收容器，切勿倒回原来容器或随意丢弃于水槽中。如果不慎将腐蚀性药剂喷溅至脸、眼或身体其他部位，应尽快以清水冲洗5分钟以上（高浓度酸液切不可直接以水清洗，需用干净毛巾将酸液擦干净后方能用清水冲洗），受伤较重者需送医院处理。
6．注意防火安全，易燃物品如二甲苯、吸水纸等应远离火源。打火机只能用于点燃酒精灯，酒精灯用完应及时盖上灯帽。用火时，实验人员不可随意离开实验室，加热结束应立即熄火。如不慎发生火灾，视具体情况，适时选用湿布、干沙或灭火器将之扑灭。
7．实验需进行培养的材料，要标明姓名、组别、日期后，放于教师指定的培养箱中进行培养。如遇菌液外溢、皮肤划伤或菌液吸入等意外，应立即报告教师及时进行处理，不得隐瞒，以免酿成后患。
8．厉行节约，对水、电、染色液、镜油、擦镜纸、吸水纸及其他药品等均应节约使用。无法使用的已损毁玻璃器皿，应置于废弃玻璃搜集箱内，不可随意丢入垃圾桶。
9．不可擅自携带任何菌种、实验仪器或药剂离开实验室，以免发生爆炸、自燃或误食等情况。
10．实验完毕，必须将仪器放到指定地点，带菌工具应先进行消毒处理。实验产生的高浓度酸、碱、含重金属或有机物等废液，应分别回收于废液回收桶中等待处理，微生物培养物应及时杀灭以免造成环境污染。
11．实验结束后应清洗桌面、实验仪器以及水槽，整理清扫实验室。检查关闭非必要之电源、水源和其他开关，以避免危险发生。洗手后方可离开实验室。
一、常用玻璃器皿及准备
微生物学实验室所使用的玻璃器皿主要用于微生物的培养（培养皿、锥形瓶）、微生物的保存（试管）、吸取菌液（刻度吸管、移液器）、制片（载玻片、盖玻片）等。使用前都需要经过洗涤清洁处理，至少无灰尘、油垢、无机盐等杂质，才能保证获得正确的实验结果。有的器皿在洗涤后还要用一定的密封包装、经过灭菌才能使用。
（一）试管
微生物学实验室所用玻璃试管，其管壁必须比化学实验室用的厚些，以保证塞棉花塞时管口不会破损。试管口的形状要求没有翻口，不然，微生物容易从试管塞与管口的缝隙间进入试管造成污染，也不便于盖试管帽。有的实验要求尽量避免蒸发试管内的水分，则需要使用螺口试管，盖以螺口胶木塞或塑料帽。培养细菌一般用金属（如铝）帽或试管塞，也可用泡沫塑料塞等。
试管的大小可根据用途的不同，准备下列三种型号（图1）：①大试管（约18mm2 ×180mm），可盛放倒平板所需的培养基，可管内制备琼脂斜面用（需培养大量菌体时用）和盛液体培养基用于微生物的振荡培养；②中试管［约（13～15）mm2× （100～150）mm］，盛液体培养基培养细菌或作琼脂斜面用，亦可用于细菌、病毒等的稀释和血清学试验；③小试管［（10～12）mm2×100mm］，一般用于糖发酵或血清学试验和其他需要节省材料的试验。
图1 不同型号的试管
图2 德汉氏小管
（二）德汉氏小管
观察细菌在糖发酵培养基内产气情况时，一般在小试管内再套一倒置的小套管（约6mm2×36mm）（图2）。此小套管即为德汉氏小管，又称发酵小套管。
（三）小塑料离心管
又称Eppendorf管（图3）。常用有2．0mL、1．5mL和0．5mL等型号，主要用于微生物分子生物学实验，小量菌体的离心，DNA（或RNA）分子的检测、提取和PCR反应等。
图3 小塑料离心管
（四）吸管
1．玻璃吸管
微生物学实验室一般要准备1mL、5mL、10mL的刻度玻璃吸管。吸管一般有两种类型，一种是血清学吸管，又称移液管（图4），这种吸管刻度指示的容量包括管尖的液体体积；另一种是不计量的毛细吸管，又称滴管（图5），可配合胶头使用，吸取动物体液和离心上清液以及滴加少量抗原、抗体等。
图4 移液管
图5 吸管
图6 微量加样器
2．微量移液器
又称微量加样器（图6），主要用来吸取微量液体，规格型号很多。每个微量吸管在一定范围内可调节，标有使用范围，例如：0．5～10μL、2～10μL、10～100μL、100～1 000μL等。使用时：①将合适大小的塑料嘴（tip）牢固地套在微量吸管的下端；②旋动调节键，使数字显示器上显示出所需要吸取的体积；③用大拇指按下调节键，并将吸嘴插入液体中；④缓慢放松调节键，使液体进入吸嘴，并将其移至接收试管中；⑤按下调节键，使液体进入接收管；⑥按下排出键，以去掉用过的空吸嘴或直接用手取下吸嘴。
除了可调的微量吸管外，也有不可调的，即一个吸管只固定一种体积。不可调的微量吸管应用范围受到限制，但使用方便。
（五）培养皿
常用的培养皿如图5所示，皿底直径90mm，高15mm，皿底皿盖均为玻璃制成。有特殊需要时，可使用陶器皿盖，能吸收水分，使培养皿表面干燥。例如测定抗生素生物效价时，培养皿不能倒置培养，则用陶器皿盖为好。在培养皿内倒入适量固体培养基制成平板，可用于分离、纯化、鉴定菌种，活菌计数以及测定抗生素、噬菌体的效价等。
图5 培养皿
（六）三角烧瓶与烧杯
三角烧瓶有100mL、250mL、500mL和1000mL等不同的大小，常用来盛放无菌水、培养基和振荡培养微生物等。常用的烧杯有50mL、100mL、250mL、500mL和1 000mL等规格用来配制培养基与各种溶液等。
（七）注射器
一般有1mL、2mL、5mL、10mL、20mL、25mL等不同容量的注射器。注射抗原至动物体内时，可根据需要使用1～5mL的；抽取动物心脏血或绵羊静脉血常用10～50mL的。微量注射器有10μL、20μL、50μL、100μL等不同的型号。一般在免疫学或纸层析、电泳等实验中滴加微量样品时应用。
（八）载玻片与盖玻片
普通载玻片大小为75mm×25mm，盖玻片大小为15mm×18mm，用于微生物涂片、染色、做形态观察等。凹玻片是在一块较厚玻片的正中有一圆形凹窝，做悬滴观察活细菌以及微室培养用。
（九）双层瓶
由内外两个玻璃瓶组成（图6），内层小锥形瓶放香柏油，供油镜观察微生物时使用，外层瓶盛放清洁液，用以擦净油镜头。
图6 双层瓶
图7 滴瓶
（十）滴瓶
（十一）接种工具
接种工具有接种环、接种针、接种钩、接种铲、玻璃涂布器（图8）等。制造环、针、钩、铲的金属可用铂或镍，原则是软硬适度，能耐受火焰反复灼烧，又易冷却。接种细菌和酵母菌用接种环和接种针，其铂丝或镍丝直径以0．5mm为适当，环的内径为2～4mm，环面应平整。接种某些不易与培养基分离的放线菌和真菌时用接种钩或接种铲，其丝的直径要粗一些，约1mm。用涂布法在琼脂平板上分离单个菌落时需用玻璃涂布器，是将玻璃棒弯曲或将玻璃棒一端烧红后压扁而成。
图8 接种针和玻璃涂布器
二、常用玻璃器皿的洗涤方法
微生物学实验中需要使用大量的玻璃器皿，在实验前均需洗涤清洁，晾干备用。洁净的玻璃器皿是保证得到正确实验结果的首要条件，因此，玻璃器皿的洗涤清洁工作显得非常重要。清洗方法根据实验目的、器皿的种类、所盛的物品、洗涤剂的类别和玷污程度等的不同而有所不同。
（一）新玻璃器皿的洗涤方法
新购置的玻璃器皿含游离碱较多，应在酸溶液或重铬酸钾洗涤液内浸泡数小时，酸溶液一般用2%的盐酸或重铬酸钾洗涤液。浸泡后用清水冲洗干净。
（二）使用过的玻璃器皿的洗涤方法
（1）试管、培养皿、三角烧瓶、烧杯等。可用瓶刷或海绵沾上洗涤剂刷洗，然后用自来水充分冲洗干净。热的肥皂水去污能力更强，可有效洗去器皿上的油污。用洗衣粉和去污粉较难冲洗干净，常在器壁上附有一层微小粒子，故要用水多次甚至十次以上充分冲洗，或可用稀盐酸摇洗一次，再用水冲洗，然后倒置于铁丝框内或有空心格子的木架上，在室内晾干。急用时可盛于框内或搪瓷盘上，放烘箱内烘干。
玻璃器皿经洗涤后，若内壁的水均匀分布成一薄层，表示油垢完全洗净，若挂有水珠，则还需用洗涤液浸泡数小时，然后再用自来水充分冲洗。
装有固体培养基的器皿应先将其刮去，然后洗涤。带菌的器皿在洗涤前先浸在2%煤酚皂溶液（来苏水）或0．25%新洁尔灭消毒液内24h或煮沸0．5h，再用上法洗涤。带病原菌的培养物应先行高压蒸汽灭菌，然后将培养物倒去，再进行洗涤。
盛放一般培养基用的器皿经上述方法洗涤后，即可使用，若需精确配制化学药品，或做科研用的精确实验，要求自来水冲洗干净后，再用蒸馏水淋洗3次，晾干或烘干后备用。
（2）玻璃吸管。吸过血液、血清、糖溶液或染料溶液的玻璃吸管（包括毛细吸管），使用后立即投入盛有自来水的量筒或标本瓶内（量筒或标本瓶底应垫有脱脂棉花，否则吸管投入时容易破损），免得干燥后难以冲洗干净，待实验完毕，再集中冲洗。若吸管顶部塞有棉花，则冲洗前先将吸管尖端与装在水龙头上的橡皮管连接，用水将棉花冲出，然后再装入吸管自动洗涤器内冲洗，没有吸管自动洗涤器的实验室，可用冲出棉花的方法多冲洗片刻，必要时再用蒸馏水淋洗。洗净后放搪瓷盘中晾干，若要加速干燥，可放烘箱内烘干。
吸过含有微生物培养物的吸管亦应立即投入盛有2%煤酚皂溶液，或0．25%新洁尔灭消毒液的量筒或标本瓶内，24h后方可取出冲洗。
吸管的内壁如果有油垢，同样应先在洗涤液内浸泡数小时，然后再行冲洗。
（3）载玻片与盖玻片。用过的载玻片与盖玻片如滴有香柏油，要先用皱纹纸擦去或浸在二甲苯内摇晃几次，使油垢溶解，再在肥皂水中煮沸5～10min，用软布或脱脂棉花擦拭后，立即用自来水冲洗，然后再稀洗涤液中浸泡0．5～2h，自来水冲去洗涤液，最后用蒸馏水换洗数次，待干后浸于95%乙醇中保存备用。使用时在火焰上烧去乙醇。用此法洗涤和保存的载玻片与盖玻片清洁透亮，没有水珠。
检查过活菌的载玻片与盖玻片应先在2%煤酚皂溶液或0．25%的新洁尔灭消毒液中浸泡24h，然后按上述方法洗涤与保存。
（三）洗涤需遵循的原则
（1）用过的器皿应随即洗掉，放置太久会增加洗涤的难度，随时洗涤还可以提高器皿的使用率。
（2）含有病原菌或属于植物检疫范围内的微生物试管、培养皿及其他容器，应先浸在5%石炭酸溶液内或蒸煮灭菌后再进行洗涤。
（3）盛有毒物品的器皿要分开处理，不能与一般器皿混杂洗涤。
（4）难洗涤的器皿不要与易洗涤的器皿一起，有油的器皿不要与无油的器皿一起，减少洗涤的难度。
（5）强酸、强碱及其他氧化物和有挥发性的有毒物品，都不能倒在洗涤槽内，必须倒在废液缸中。
（6）用过的升汞溶液，切勿装在铝锅等金属器皿中，以免腐蚀金属器皿。
（7）任何洗涤法，都不应该对玻璃器皿有所损伤。所以不能使用对玻璃器皿有腐蚀作用的化学试剂，也不能使用比玻璃硬度大的制品来擦拭玻璃器皿。
三、玻璃器皿的包扎
（一）培养皿的包扎
培养皿常用牛皮纸或旧报纸密密包紧，一般以5～8套培养皿作一包，少于5套工作量太大，多于8套不易操作。包好后行干热或湿热灭菌。如将培养皿放入金属（不锈钢）筒内进行干热灭菌，则不必用纸包，金属筒有一圆筒型的带盖外筒，里面放一装培养皿的框架，此框架可自圆筒内提出，以便装取培养皿。
（二）移液管的包扎
准备好干燥的吸管，在距其粗头顶端约0．5cm处，塞一小段约1．5cm长的棉花，以免使用时将杂菌吹入其中，或不慎将微生物吸出管外。棉花要塞得松紧恰当（过紧吹吸液体太费力；过松吹气时棉花会下滑），然后分别将每支吸管尖端斜放在报纸条的近左端，与报纸约成45°，并将左端多余的一段纸覆折在吸管上，再将整根吸管卷入报纸，再将右端多余的报纸打一小结（图9）。如此包好的很多吸管可再用一张大报纸包好，进行干热灭菌。
如果有装吸管的铜或不锈钢筒，亦可将分别包好的吸管一起装入筒内，进行灭菌；若预计一筒灭菌的吸管可一次用完，亦可不用报纸包，而直接装入筒内灭菌，但要求吸管尖朝筒底。使用时，将筒卧放在桌上，用手持粗端抽出。
图9 移液管的包扎
（三）试管和三角烧瓶等的包扎
试管管口和三角烧瓶瓶口塞以棉花塞（图10）或泡沫塑料塞，然后在棉花塞与管口和瓶口的外面用两层报纸或平皮纸以细线包扎好（如果能用铝箔，则可省去用线包扎且效果更好）（图11）。进行干热或湿热灭菌，试管塞好塞子后也可一起装在铁丝篓中，用牛皮纸或铝箔将一篓试管口做一次包扎，包纸的目的在于保存期避免灰尘侵入。空的玻璃器皿一般用干热灭菌。
图10 试管棉塞的制作
图11 三角瓶的包扎
四、玻璃器皿的干热灭菌
干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白蛋凝固就越快，反之含水量越少，凝固缓慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度更高（160～170℃），时间更长（1～2h），但干热灭菌温度不能超过180℃，否则，包器皿的纸或试管塞会碳化，甚至引起燃烧。干热灭菌的步骤如下：
（1）将包好的待灭菌物品（培养皿、试管、吸管等）放入电烘箱内，关好箱门。物品不要摆得太挤，以免妨碍空气流通，灭菌物品不要接触电烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火。
（2）接通电源，拨动开关，打开电烘箱排气孔，让温度逐渐上升。当温度升至100℃时，关闭排气孔，直至达到所需温度。
（3）当温度升达到160～170℃时，恒温调节器会自动控制调节温度，保持此温度2h。干热灭菌过程要严防恒温调节的自动控制失灵而造成安全事故。
（4）切断电源、自然降温。
（5）待电烘箱内温度降到70℃以下后，打开箱门，取出灭菌物品。电烘箱内温度未降到70℃，切勿自行打开箱门以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。
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