在研究工作中，为了能够分别操控不同的细胞群体，可以通过确认特异型式的基因表达来区分细胞类型，例如离子通道、神经调制物、转录因子等。这样一来，研究脑功能的方法就变得越来越细致了，可以在多种神经元互相混杂的神经网络节点上，用基因表达标志物来界定有确定分子的细胞类型，从而把神经元区分开来。对于标记基因的启动子组件，可以转用来驱动神经元执行机构（actuator）的转基因表达。最引人注目的是，可以运用Cre重组酶，用它来选择性地开启Cre依赖的病毒载体表达，获得能够产生荧光蛋白及突触追踪物质的小鼠细胞系；也可以应用光遗传学药物动力学工具来激活或者静默神经元。这种基因编码工具正在快速地促进人们了解各种因果关系的研究取得进展，包括了解不同类型神经元的活动、它们在神经回路中的功能，以及它们与动物行为功能之间的关系［10］。
虽然已经有大量的工作显示，脑区间的轴突投射有着非常精细的型式，但对于由分子界定的细胞类型之间的轴突连接进行作图，工作还只是刚开始。如同在其他脑区里一样，下丘脑内的许多细胞群体是混杂在一起的，具有不同的甚至相反的功能。在Cre依赖的病毒载体表达荧光蛋白的条件下，允许作图细胞类型特异的下丘脑投射。通过基因技术，下丘脑不同细胞类型群体之间的突触连接可以被探查。例如，应用细胞类型的特异表达和向前运输的麦芽凝集素及大麦植物凝集素，可鉴定已确定为瘦素受体神经元的下游细胞；而应用破伤风毒素亚单位的表达，可提供增食欲肽/下丘脑泌素神经元的输入图像。此外，为了全面地作图神经回路中已经过分子鉴定的细胞类型的上游及下游，相互连接细胞间的向前传导和逆向标记病毒工具也正被广泛应用。还有被称为突触伴侣间GFP再造（GFP reconstitution across synaptic partner，GRASP）的另一方法，它是对突触接头两侧劈裂GFP（split-GFP）的再造，通过它可以鉴定细胞类型之间的连接［10］。
综上所述，这些解剖学的研究途径揭示了神经线路图，但是还缺少反映连接活性正性或负性、反应强度大或小的那种线路。借助于ChR依赖的网络作图，辅之以ChR2对轴突突起的有效分布和进入，再应用突触生理学方法，就可以考察局部的以及远隔部位的、已经过分子鉴定的两个细胞类型之间的连接。在应用这种方法时，一个突触前神经元群体，或者甚至从细胞体切断下来的轴突，也可以被所用的光波所兴奋；同时还可用电生理学方法进行突触后细胞反应的记录，所记录的是潜在的突触后细胞，通常可用细胞类型特异表达的荧光标记蛋白来加以鉴定。如果出现短潜伏期的突触反应，那就表明了神经元之间的连接。应用这种通道视紫质依赖的神经回路作图实验，可以测定细胞类型之间的连接概率、其功能突触的特征、神经连接对于突触后某种细胞类型活动的影响。总的说来，应用了轴突投射的解剖性和功能性的突触连接分析这两种互补技术以后，就为研究下丘脑内（图12-5a）及下丘脑和其他脑区的传导通路，提供了一个非常有效的强有力研究框架［10］（详见17.5、17.6、17.7）。
图12-5 细胞类型特异的神经回路的功能性回路作图及行为评价
（a）对于分子性质已经鉴定的神经元，可以用借助通道视紫质方法的神经回路的作图，来测定突触后靶，也可测定突触的功能性质。上右：突触后电流的图例。（b）对于作为例子的一个抑制性神经回路，可以用细胞类型特异的神经元激活/静默技术来测定，是否突触前神经元群体对于突触后群体的激活或抑制就足以引起行为反应。（c）光刺激某种细胞类型（抑制性）投射到特异靶区的轴突投射，同时检测其行为反应。已经在分子性质上鉴定了细胞类型的轴突，其解剖学一般是不清楚的，可以联系到已经在分子性质上得到鉴定的细胞类型的每个细胞，而那种细胞是投射到多个靶区的（轴突侧枝的连接）；也可以是每个投射靶来自分子性质上已得到鉴定的细胞类型的亚群（一对一的连接）。对于有侧枝连接的轴突来讲，反向传播的动作电位可以激活轴突侧枝，从而投射到其他脑区。这样一来，需要增加实验来证明这个行为效应是不是激活特定投射的后果。（d）特定神经回路连接的功能必要性检测。左：已经鉴定的抑制性连接的行为作用，其典型的测试方法是在局部区域应用一些对于被鉴定的突触后神经元并非细胞类型特异的试剂，以阻断抑制。这样一来，这些区域里面的所有神经元，不管其连接性情况如何，都从抑制中解脱。右：通过同时激活突触前神经元（或其轴突），以及一个在分子性质上得到鉴定的突触后神经元群体，而引起突触抑制性的细胞类型特异的阻塞。因为突触前神经元也投射到其他细胞群体，所以这个测试针对的是此特异神经回路连接的行为必要性，而所有其他的靶都接受诱发的突触输入。（图引自［10］）
外活体（ex vivo）情况下的功能性神经回路作图，这种途径为活体实验提供了一座桥梁。活体实验仅能测试个别回路节点之间连接的行为影响（图12-5b）。通过操控分子性质以界定细胞类型活性从而诱发复杂行为的能力就提供了一种机会，可以运用神经回路作图及扰乱技术的全部强有力本领，用来检测下游神经回路元素在介导行为反应方面的作用。在同时监控其行为反应的条件下，不同的靶脑区、特定类型细胞的轴突投射野，可以局部地被激活/静默。激活轴突投射是要小心注意的。例如动作电位的逆向传导，它可以激活轴突侧枝而到另一脑区（图12-5c）。由局部轴突激活而引起的行为反应，应该伴以相应突触后靶的操控，例如用药理学方法局部阻断靶区神经递质的释放，以检测回路相互作用对行为反应是否既是充分的又是必要的（图12-5d）。对于分子性质得到鉴定的两个细胞类型之间的连接来说，药理学阻断方法还不够特异。在此种情况下，对特定细胞群体来说，突触后激活/静默（取决于被作图的突触相互作用是正的还是负的）可以用来演示下游细胞类型是否即重塑与突触前细胞类型有关的那个反应之充分条件（图12-5b）。为了检验分子性质得到鉴定的神经回路相互作用的必要性，在操控突触后神经元的时候可以同时操控突触前神经元并检测行为：对于一个足够诱发行为的兴奋性神经元来说，这意味着要同时静默一个突触后伴侣；而对于抑制性神经元来说，测试方法应该是突触后群体的同时激活（图12-5b）。总的情况是，应用操控单个神经元群体以快速诱发行为的框架，易化了神经系统中的反向基因工程线路的操控，而神经系统本身又受缓慢变动着的生理参数的调节。由于操控神经元功能的新工具出现，再加上能够得到这种小鼠细胞系（它具有细胞类型选择的Cre重组酶表达，既可以表达在内感受性神经元上，也可以表达在它上游或下游神经回路的节点上），下丘脑神经元的神经回路越来越容易被分析，而且在它们那种有趣的行为和生理学作用的背景之下进行分析［10］（参见17.5、17.6、17.7）。
有研究应用一种数学模型——Ising模型（Ising model），以重新评价通常被认为是听觉皮层神经回路的连接关系。这里所分析的神经回路，属于大脑皮层内的局部回路。实验应用光遗传学途径，用光激活小清蛋白阳性（PV+）神经元。所得的主要结果有三：①该激活增加大脑皮层柱内的功能连接；②该激活并不改变大脑皮层的层与层之间的水平连接；③该激活增加自下而上的感觉输入对于知觉的作用［11］。
哺乳动物新大脑皮层是高度相互连接的不同神经元所组成的神经网络，它不但在层与层之间有连接，而且在柱内的上下之间也有连接。复合在此结构组构上面的是一种型式的功能连接。当行为改变时，这种型式可以出现快速、有伸缩性的改变。PV+神经元是一种抑制性神经元，被认为在大脑皮层振荡中起作用，可以改变神经元的选择性。它可能在动力变化中起重要作用。研究发现，光遗传学激活听觉皮层PV+神经元，可以增强公认的丘脑接受神经回路及皮层柱神经回路中的前馈性功能连接。与此不同，在PV+神经元被激活时，同一层中的连接没有发生改变。因此，PV+神经元可以作为一种门控机制，在皮层神经回路里面增强前馈，但不影响侧向或反馈信息的流动。从功能上看，它可能优先地增强自下而上的、知觉的感觉输入［11］。
神经元在动态调制的神经回路中相互作用。功能连接是测定这些回路神经元之间相互作用的一个指标。在学习或长时程记忆中，功能连接可以慢慢变化；在依赖于行为情景及认知需要的时候，也可以快速变化。实现神经网络长时程可塑性的机制，已经广泛地得到了认可，但是那种快速调制功能连接的机制，仍然大部分不清楚。在神经网络水平，功能连接可以受到上、下状态以及神经回路振荡状态的影响，皮层抑制在此过程中起关键作用。PV+中间神经元占了大脑皮层抑制神经元的半数以上，对于大脑皮层的活动特别重要，因为它们提供了强的前馈和反馈抑制，而前馈和反馈抑制是可以使大脑皮层神经网络同步化的。然而，有关它们在感觉加工过程中对于皮层神经网络的确切影响仍不清楚。特别不清楚的是，PV+神经元是否可能有差别性地调制新大脑皮层不同层次的神经元反应，而这种大脑皮层的解剖学组构又是如何影响网络信息流动的［11］。
组织学研究显示，大脑皮层包含确定的几个层次，而且在垂直层次之间也有投射。皮层网络之间的功能连接通常是通过测定一对神经元锋电位之间的相互关系来研究的。更少知道的是，在感觉刺激时的功能连接如何，以及抑制在皮层神经回路中的作用如何。我们结合多种计算途径并与光遗传学激活PV+神经元相结合，以此来确定抑制性活动如何调制大脑皮层的层与层之间、大脑皮层柱之间的神经回路连接性［11］。
在光遗传学方法方面，实验靶向光敏感通道蛋白质——ChR2，将其表达于小鼠听觉皮层的PV+神经元（图12-6a），应用了Cre依赖的腺相关病毒载体。感染后一个月，在小鼠的对侧耳朵处发出纯音刺激，将4×4多电极放在初级听觉皮层的拟定的Ⅱ/Ⅲ层直到Ⅳ层，以记录神经元反应，同时再用蓝光刺激PV+神经元（图12-6c）［11］。
图12-6 病毒的表达、记录的安排、对纯音反应的记录以及光遗传学刺激（彩图见图版此处）
（a）对转基因的PV∷Cre小鼠注射1 μl的Cre可诱导的相关病毒到右侧听觉皮层，就使得此听觉皮层的PV+神经元被感染上光敏感的离子通道ChR2。组织学检查结果确定，ChR2-EYFP（左）共定位于听觉皮层PV+神经元（中，以及用Alexa 594进行免疫染色，右）。大约58%的PV+神经元被ChR2转染。比例尺：50 μm。（b）表示记录安排的图解。一个4×4硅多电极向大脑皮层垂直插入，最深位点位于离皮层下约500 μm处，再用一个直径为200 μm的光学纤维耦合于473 nm的蓝色激光，位置摆到与多电极平行，在皮层上1～2 mm，在50%的实验中提供光遗传学的刺激。（c）为示例实验及锋电位栅线（raster）而作图的光和声音刺激条件。输入到Ising模型的锋电位是二进位矩阵，包括每个时间点上光的条件（蓝色杠代表给予光的时间，PV+神经元受到刺激）、每个时间提供的纯音频率（玫瑰红色）、每个通道的锋电位资料。以5 ms的时间间隔采集。在每次1 s的试验中，声音和光的条件作随机穿插。（图引自［11］）
用Ising模型来定量化描述皮层回路神经记录点之间的功能连接性。以前在许多其他系统中，Ising模型已被证明可以作为神经相互作用的模型。Ising模型描写的是一种耦合关系，这种耦合根据观察到的相应刺激及集群放电的形式，测定它们的功能连接性，考察一对记录位置之间有没有耦合，以及在记录位置和外加刺激之间有没有耦合（图12-6b，c）［11］。
Ising模型应用于神经科学是这样的：可以对脑内神经元的活性作模型化统计学处理，每个神经元在每个时间或者进行阳性活动（+），或者不活动（-）。活动的神经元沿着轴突输出一个动作电位，在任何时间窗口；不活动的神经元就不输出。因为任何一个时间的神经元的活性，是由一些独立的比特（bit）所规定的，所以J. Hopfield提出，可以用一个动力学Ising模型来初步逼近一个神经网络，而网络是会学习的。
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