影响电泳迁移率的因素

(一)分子的形状和性质

指带电粒子的分子大小、形状及电荷量。蛋白质、核酸等生物大分子大小差别较大,分子越小,电泳速度越快;在相对分子质量接近时,球状分子比纤维状分子移动速度快;分子所带电荷越多,移动速度越快。

(二)电场强度

电场强度是指单位长度(cm)的电位差,亦即电势梯度。电场强度越大,带电质点的迁移率越大,越节省时间,但同时电流也增大,产热增多。支持介质温度增高可使水分蒸发加速,所以应配冷却降温装置,以维持最适温度,防止待测样品变性。电场强度降低,产热减少,但电泳速度变慢,电泳时间延长,增加了标本的扩散,导致区带模糊,分辨率下降。

(三)电泳缓冲液的p H

电泳缓冲液决定样本的解离程度和荷电性质。缓冲液的p H与pI差距越大,解离程度越大,所带净电荷越多,电泳速度越快;相反,电泳速度越慢。但缓冲液不能过酸或过碱,以免使蛋白质变性,缓冲液的p H一般设在4.5~9.0为宜。

(四)缓冲液的离子强度

缓冲液一方面维持环境的p H,还起着导电的作用。因此,缓冲液必须具有一定的离子强度。离子强度的计算公式为

式中:I为离子强度;C i为离子浓度;Z i为离子价数;∑代表累加。

离子强度高,缓冲液所载分电流大,样品所载分电流则小,样品的电泳速度减慢;离子强度低,缓冲液所载分电流小,样品所载分电流则大,样品的电泳速度加快。离子强度大,总电流强度大,产热多,蒸发快;离子强度小,总电流强度小,产热少,蒸发慢。电泳速度过慢,会导致电泳时间过长、标本扩散;电泳速度过快,导致区带不整齐,分辨率下降。所以,电泳缓冲液离子强度应设置在一个最佳数值,一般设在0.02~0.2为宜。

(五)电渗

电泳过程中,液相在固相支持物上的相对移动现象称为电渗。由于固相支持物常带有可解离的化学基团,形成电荷层。如淀粉、纤维素和琼脂糖等表面具有许多羟基,电离后带有负电荷,在固相支持物上形成负电层,吸附缓冲液中的阳离子,形成贴壁正电层,在电场作用下向负极移动;相反,如果支持物表面带有正电荷,则形成贴壁负电层,向正极移动。由于电渗的影响,使样品泳动速度改变,当带电颗粒的电泳方向与电渗方向相同时,电泳速度加快;反之,电泳速度减慢。因此,应尽可能选择低电渗作用的支持物以减少电渗的影响。