生物修复中的生物强化

七、生物修复中的生物强化

从广义说生物强化可以认为是开发提高一种生物系统的潜在能力的方法。生物修复中的生物强化是向处理系统投加外源降解微生物(或降解菌、降解酶和降解遗传信息)，通过加入具有特殊作用的高效降解微生物补充或替代原有土生微生物，从而优化降解微生物的群落结构，增加具有降解作用生物的生物量，提高降解活性，加速污染环境中污染物的降解反应，达到缩短修复时间，降低处理成本的目的。生物强化是20世纪80年代提出的一种新的概念，特别是在生物修复中被强调，并且成为生物修复中一个研究的热点。但生物强化这种理念及其应用则在传统生物技术中早已经得到应用，如接入根瘤菌促进结瘤和固氮，接入菌根真菌促进植物菌根形成。一般来说在良好环境条件下污染物的生物降解速率仍然很慢时，这时就需要进行生物强化，生物强化已经成为一种促进生物降解的重要工具。生物强化主要在下列情况下使用:①污染物的浓度高到对土生微生物区系产生毒性。②在一种污染物泄漏到环境，并对环境中的内源修复具有抑制作用时。③用生物反应器异位处理污染介质时，由于可以维持最佳条件，加入高效外源微生物可以取得良好效果。

1.生物强化的成功个例

从生物修复研究中的多种实验室水平研究，中试水平以及野外研究到传统的污水处理都已证明生物强化的成功(表10-2)。

表10-2　　部分生物强化研究和应用的成功例证

续表

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*pcp:pentachorophenol五氯苯酚，TCE:Trichloroethylene三氯乙烯，PTS:P-toluene P-甲苯，sulfonate:磺酸盐，3-CB:3-chloroenzoate 3-氯苯甲酸盐，DCE:dicholroethene二氯乙烯，VC:vinylchloride氯乙烯，hpAHs:high molecular weght polyaromatic hydrocarhon高分子量多环芳烃，3-CA:3-chloroaniline3-氯苯胺，PNA:polynuclear aromatic多环芳香烃，B(a)P:Benzo(a)pyrene苯并(a)芘，CP:chlorinated phenols氯代酚，DNT:dinitrotoluene二硝基甲苯，IPA:isopropyl alcohol异丙醇。

2.生物强化的实施及影响因素

(1)生物强化外源微生物的种类及获得

从总体上说生物强化技术是向降解系统投加高效特异性降解污染物的微生物，但具体使用的微生物种类却是多样性的。就微生物生理遗传改造的程度而言可以有:适应驯化微生物、遗传修饰微生物(genetically modified microorganisms，GMMs)和基因工程微生物(genetically engineered microorganims，GEMs)，遗传修饰微生物主要是指经诱变处理、转化、转导和原生质体融合等方法得到的高效降解微生物，而后者是经基因工程体外重组所得到的工程菌，目前使用最多的仍然主要是前二类微生物。从微生物组成大类上说主要是细菌及真菌，从组成上说有单种、多种或菌群(consortia)。

自然环境特别是污染环境中经过适应和驯化的微生物是寻找高效降解菌的最丰富资源。目前使用的生物强化菌大多是从污染环境中富集分离，并经遗传修饰得到的，有的外源降解菌的突变株成为组成型的降解菌，而许多基因工程菌的外源降解基因也来源于这些最初的分离菌。但基因工程菌的构建和应用越来越重要，显示出在生物强化中将发挥重要作用。

(2)外源降解菌的培养与投加

要使外源降解菌在实际处理系统中发挥作用，外源降解菌就要占有一定比例，因此使用前外源菌的培养是十分必要的。一般情况下要把降解微生物培养在以要降解的有机物为唯一碳源、能源的培养液中，微生物生长到对数期即可收集使用，但也有因特殊需要而以其他方式培养的，如用泥浆生物反应器培养活性土壤。

外源降解菌的投加主要有大量投加和少量投加二种方式。对于降解能力强，但适应现场环境及竞争能力(与土著微生物)不强的微生物一般需要大量投加这种毕其功于一役的方法才能发挥较好的作用，此外也可根据实际需要重复投加。对于那些降解能力、适应能力以及竞争生存能力都较强，可以持久发挥作用的微生物可以少量投加，它们在降解系统中逐渐成为优势菌，以充分发挥其独特的降解优势。

投加过程中必须使外源菌到达作用位点才能发挥强化作用。实验研究一般把培养物直接加入处理系统，但在实际应用中投加方式以及提高外源菌的运动迁移能力是十分重要的，如通过根际定殖可使根际微生物发挥重要作用。低离子强度溶液和表面活性剂可以降低细菌对表面的吸附能力，提高迁移能力，有助于外源微生物到达作用位点。此外反复接种也可以提高强化效果。

(3)提高外源降解菌活性和存活能力的基本方法

生物强化中投加的外源降解菌面临的是一个十分复杂的生态系统，不管以何种方式强化，外源降解菌都要克服新环境的各方面胁迫以及与土生微生物竞争营养和生存空间，因此一般来说，投加的外源微生物的数量会减少，活性会降低，不能充分发挥生物强化作用。解决这个问题的途径是使降解微生物具有更高的降解活性，更持久的存活能力，在降解系统中成为优势菌，提高外源降解菌的活性和存活能力是实现生物强化的基本条件。

外源菌的存活和活性主要取决于生理状态、生物学特性以及对环境条件的适应，从根本上说提高它们活性和存活能力的基本方法是提供一个良好的生态位，进而使它们占据良好生态位。目前研究提出的主要方法有:①外源降解菌在污染环境中的进一步适应和驯化。②通过细胞融合等方法使高效降解菌带有土生菌的生理特性，从而具有更强的存活、竞争能力。③通过固定化使外源降解菌获得一种更好的生态位，存活能力及降解活性都得到加强，生物强化作用更加明显。固定载体包括蛭石、藻酸钙、熔融琼脂、聚氨酯泡沫塑料、几丁质等。有的研究还把载体聚氨酯经化学处理，使之具有良好的吸油性能，同时又作为降解微生物的固定载体，再加入必需的营养物质，从而把物理化学吸附作用和生物降解作用结合起来，大大提高了净化效能。④使降解菌具有某一生理遗传特点，以便在特定条件下取得竞争优势，例如把降解菌驯化成表面活性剂低利用能力的耐受菌，从而在加入表面活性剂提高疏水性有机物溶解性的处理中取得生长优势。

(4)提供良好环境条件，充分发挥生物强化作用

和任何生物过程一样，生物强化也受到环境条件等多种因素的制约，只有提供良好的环境条件才能充分发挥生物强化作用。一般把生物促进和生物强化结合起来，同时保证适合的pH值、温度、含水量等环境条件，这样就可以取得良好的生物强化效果。

(5)影响生物强化作用的因素

向一种降解系统投加外源降解微生物会受到系统内多种因素的影响和制约，主要包括:①对微生物致毒的毒性物质。②微生物捕食者的存在及活性。③影响微生物生长存活的环境条件(如营养、pH值、温度等)。④影响细胞和污染物接触的因素。外源微生物在污染区的运动和分布是决定与污染物接触先决条件，而其受到固体表面的吸附及多孔基质过滤的抑制。

3.基因生物强化

有的学者把生物强化分为细胞生物强化(cell bioaugmentation)和基因生物强化(gene bioaugmentation)。细胞生物强化是指接入的外源微生物以细胞的形式发挥生物强化作用，现在一般说的生物强化是细胞生物强化，而基因生物强化是指通过降解遗传信息转移实现的生物强化。大量研究实验证据表明外源降解菌的降解遗传信息(主要是降解质粒)可以传递给土生的细菌体群，从而改变微生物群落的遗传信息结构，提高系统对特定污染物的降解能力，这样即使外源菌不能在新环境中存在也实现了生物强化。研究人员通过实验证实了下述的生物强化过程(图10-1)。在这个研究中接入的微生物是真养产碱菌JMP134(Alcaligenes eatrophus JMP134)，该菌株带有80kb的质粒pJP4，能编码降解除草剂2，4-D的初始酶。研究时建立一系列土壤微宇宙，使土壤受2，4-D污染，在对照的微宇宙中经过1周2，4-D被缓慢不完全降解。在另一个系列中JMP134被接种到土壤中，并使其浓度达到10⁵CFU/g±。经一周迟缓期后2，4-D被快速降解，在4周后2，4-D被完全降解。在研究过程中，研究者们非常仔细地检测了微宇宙的2，4-D降解群体。他们的发现令人吃惊，在第一周就已经找不到活的JMP134菌株，但在2、3周后分离到了两种新的能降解2，4-D的细菌，经鉴定为格氏假单胞菌(Pseudomonas glatnei)和石竹伯克霍尔德氏菌(Burkholderi caryophyllii)，并发现它们带有pJP4质粒。在第五周又分离到新的降解菌，为洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)，其也携带有pJP4质粒。随后再把2，4-D加到微宇宙中，发现2，4-D很快被降解，而且起主要作用的是第三种分离出来的降解菌。研究结果清楚表明外源菌的pJP4质粒已经被转移到土著的微生物群体。推测这种转移过程有二种可能性。其一是通过细胞与细胞相互接触的接合作用实现质粒的转移;其二是细胞死亡裂解后释放出来的pJP4质粒被土著种群吸收，这种过程被称为转化。

4.外源降解微生物及其降解基因的跟踪与监测

在生物强化的研究及应用中，为了评价降解微生物的存活、活性、降解群体的结构，及降解基因的表达，就需要进行跟踪和监测。基本的方法是PCR定量分析和分子标记基因系统，前者对特定基因或基因片段扩增后定量测定，后者通过细胞的标记间接测定细胞数量及其活性。此外还有免疫荧光分析等方法。

图10-1　生物强化过程

PCR定量分析技术主要包括MPN-PCR、RLD-PCR、RT-PCR和CPCR。分析标记基因系统包括抗生素抗性基因和编码代谢酶基因，包括xylE(编码儿苯酚2，3-加氧酶)、Laczy(编码β-葡萄糖醛酸酶)、gus A(编码β-葡萄糖醛酸酶)，通过分子杂交及特异性的产物可以检测到这些基因的存在。而应用更为普遍的是编码绿色荧光蛋白的gfp基因，其源于水母，用这种基因标记的优越性是gfp所发荧光不依赖于基质和能源，带有荧光标记的细胞易于在荧光显微镜中检出。另一个被推荐使用的标记是luc或luc(细胞的荧光素酶)，这种标记产生的生物荧光直接和细胞的代谢活性相关。现在正在发展由luxAB和GFP基因组成的一种双重标记系统。luxAB标记的生物荧光表型依赖于细胞的能量状态，生物荧光的发出直接和细胞的代谢活性相关，而GFP的荧光不需要能量，因此这两种生物标记的结合可以使经过标记的特定细胞群体的数量和代谢活性同时被监测。相关研究所使用的部分监测方法列于表10-3。

表10-3　　监测外源降解微生物及其降解基因的部分方法

*FDA:fluorescein diacetate hydrolyzing activity(荧光素双醋酸盐水解活性);ELISA:enzyme-linked immunosorbent assay(酶联免疫吸附分析);菌株专一性DNA探针:strain-specific DNA probes;DGGE分析: Denaturing gradient gel electrophoresis(变性梯度凝胶电泳)