实验动物物种和个体因素

二、实验动物物种和个体因素

研究植物源化合物的毒性，至今仍以体内试验为主。体内试验是以实验动物为模型，通过化合物对实验动物的毒性反应，了解该化合物的毒性大小、作用方式、作用机理等。所以，选择适合的实验动物物种与品系十分重要。

1.实验动物的物种与毒性反应

研究植物活性成分对鼠类的毒性反应，选择适宜的实验动物物种至关重要。为了外推毒理学资料，考虑对人类的安全性，首先应考虑所选的动物物种对待测化学成分的毒性反应及其在机体内的代谢与人类是一致的，即实验动物的毒理学资料能够预告对人的危险性。另一方面还应注意到可行性，即所选择的实验动物物种是经济的，易于大量获得，易于饲养，而且应是纯种品系。

依此原则，在实验中常选择的动物主要是大鼠（rat）、小鼠（mouse）和豚鼠（guinea-pig）三种。据报道，使用大鼠为实验动物的毒理学研究在文献上统计占49%以上，小鼠约占21%，从所研究毒性的化合物数量上统计，大鼠与小鼠各占23%。

但是，以上几种实验动物对各外源化合物的毒性反应、毒理表现并不完全一致，这是由各种动物物种生命特征所决定的。它们的寿命周期、性成熟期不同，解剖学与生理学也各有特征，如大鼠无胆囊，由肝输出胆管直接开口于十二指肠；大鼠、小鼠无呕吐反射等；在遗传学上也有差异。它们在遗传、解剖、生理、代谢方面的种种差异反映进化上的不同，决定了它们的生理功能上与生化功能上的差别，表现出对同一种药物的敏感性不同，而表现出毒性的差异。如一叶所含主要有毒成分一叶碱，小鼠腹腔注射的LD₅₀为25mg／kg，而大鼠为41mg／kg；小鼠口服川楝素的LD₅₀为479.4～2194mg／kg，而大鼠为106.8mg／kg。

2.实验动物的品系与毒性反应

每种动物物种均有不同的品系，这是由复杂的环境影响与适应导致遗传受异所致。以同为啮齿目的兔为例，就有中国本兔（嘴较尖、耳短厚、白色）、青紫蓝兔（银灰色毛、抵抗力强于中国本兔）、日本大耳兔、新西兰兔等品种。实验室使用的大鼠为白色毛，它是由野生褐鼠经饲养变异而得。大鼠又经各实验室多次杂交筛选繁育形成了几十个不同品系的纯种。不同品系动物都存在着各自的遗传特征，在免疫应答、生化酶系等都有着一定的差别。所以在毒性研究中，就要求使用纯合型品系实验动物，因对其遗传背景、特征了解得较为清楚。

在毒性研究中应注意动物品系不同所表现出的毒性差异。如给予小鼠甲基汞（meth-ylmercury）经口染毒每日5mg／kg，连续给毒，开始出现中毒症状时间，BALB／CA小鼠就早于C57BL／6N小鼠，且后者雄性尿汞很高，而脑、肝、肾和血中汞浓度却低。又如Stock系小鼠腹腔注射丙烯腈LD₅₀为15mg／kg，而NR系则为40mg／kg。

3.实验动物的个体因素与毒性反应

以剂量对数与累计死亡率为坐标的剂量——反应曲线多呈“S”型曲线，可看出相同的动物物种、相同品系、甚至同窝动物均表现出对同一外源化合物毒性反应的个体差异，即动物的个体在相同的遗传背景下会有某些变异，且将对化合物的毒性反应出现差异。其原因是非常复杂的，至今难于分析清楚，一般来讲，如下几个方面因素是常见的影响化合物毒性反应的个体因素。

（1）性别：成年动物生理特征的差别最明显的是性别因素，雌雄动物性激素的不同，以及伴随而来的其他激素，如甲状腺素、肾上腺素、垂体素等水平均有不同。激素水平的差别，将使机体生理活动出现差异。例如，Cyt-P-450可受“垂体－下丘脑”系统内分泌的调节，因此外源化合物在不同性别动物体内的代谢就存在差别；MFO酶系在两性动物间被化合物诱导或抑制的结局也有所不同，从而表现出对外源物质的毒性差别。如在研究曼陀罗对小鼠的毒杀作用时发现，曼陀罗茎在48h内对雄性个体的毒杀率为57.1%，对雌性个体的毒杀率仅为6.7%；果壳在48h内对雄性试鼠的毒杀率为33.3%，对雌性试鼠的毒杀率为6.7%，差别均非常明显。

关于实验动物性别与化合物毒性反应的差别，有报道指出，大鼠和小鼠对149种化合物的性别毒性比值（雌性LD₅₀／雄性LD₅₀）小鼠为0.92，大鼠是0.88（张铣等，1997）。因此，毒性研究一般应当使用数目相等的两种性别动物，若化合物性别毒性差异明显，则应分别用不同性别动物再进行试验。

（2）年龄：年龄因素大体上可区分为3个阶段，从出生到性成熟之前、成年期和老年期。由于动物在性成熟前，尤其是婴幼期机体各系统与酶系均末发育完全，肾功能发育也不全，胃酸低，肠内微生物群也末完善，因此对外源化合物的吸收、代谢转化、排出及毒性反应均有别于成年期。如小鼠肝脏Cyt-P-450在新出生后15d的水平、谷胱甘肽在出生后10d的水平才能达到成年期。而动物步入老年各系统生理功能又走向衰退。一般讲，化合物的母体毒性大于代谢物毒性时，幼年期与老年期的毒性表现就比成年动物敏感；而化合物的母体毒性弱，经代谢转化增毒时，反映在成年毒性就大，而婴幼期与老年期毒性就低。如八甲磷于体内在一个甲基上羟化后毒性增加，当以35mg／kg给初生大鼠经口染毒不会引起死亡，但此剂量可引起成年大鼠100%死亡，老年大鼠只死亡20%；马拉硫磷在体内代谢降解快，新生大鼠LD₅₀为134.4mg／kg，而成年大鼠LD₅₀为3697mg／kg，毒性相差达到27倍以上。

有报道，在222个外源化合物中，未成年动物（婴幼期）对其中78%的化合物的LD₅₀值比成年动物低，即毒性大。也有报道，化合物对成年动物的LD₅₀（或致死剂量）与新生动物的LD₅₀（或致死剂量）的比值在0.002～16之间，表明既有对新生动物毒性反应低的，也有毒性反应强的。

（3）生理状况：实验动物处于某些疾病状态时，对某些化合物的毒性反应必然有差异，如肝、肾疾病等，雌性动物于孕期和哺乳期生理状况有别于非孕期、非哺乳期，对某些化合物的敏感性也存在差别。

动物在正常生理情况下还存在着生物时间节律，这是生命的基本特征之一。依据生物学上这种时间特性研究外源化合物的毒性作用规律，称之为时间毒性（Chronotoxicity），甚至出现了时间毒理学（Chronotoxicology）的称谓。动物的生物时间节律是基于在动物体内存在着的时间结构（temporal organizations）。

由于时间节律的存在，实验动物对外源化合物的代谢与毒性反应就表现出时间差异。例如给小鼠相等剂量乙醇腹腔注射，以每4h为一个分组时间，结果在晚8点死亡率最高，大致相当其他时间组死亡率的2～3倍；小鼠给予相当LD₅₀剂量的茶碱（theophylline），在早4点有10%小鼠死亡，下午4点则死亡75%。当大鼠给予相等剂量的苯丙胺（amfet-amine），于早3点组死亡78%，而在早8点组仅死亡7%（张铣等，1997）。可见外源化合物具有毒性时间节律差别。因此，在毒性试验研究中，尤其是亚慢性与慢性试验的每日染毒时间必须固定，以防止出现毒性时间差异。在长期试验中，凡需定期采集血、尿或脏器进行化验检查，也应事先明确设计采集样品的时间，使试验时间规范化，以减少或防止时间误差，利于进行毒性效应的比较。

（4）营养状况：合理的全营养素对维持机体健康、正常生理活动至关重要，营养失调将影响机体对外源化合物的毒性效应。当食物中缺乏必需的脂肪酸、磷脂、蛋白质及一些维生素（如Va、Ve、Vc、VB2）及必需的微量元素（如Zn、Fe、Mg、Se、Ca等），都可使肌体对外源化合物的代谢转化发主改变。一般来说，低蛋白质饲料多引起机体对化合物的毒性反应增加。

研究外源化合物经口毒性一般要求实验动物隔夜禁食（fasting），以防止消化道充盈时影响化合物吸收，或未完全消化吸收的食物与化合物起化学反应；但是实验动物禁食与不禁食胃液的pH有变化。据文献报道，禁食与否，化合物吸收的动力学过程也有差别。所以，在经口染毒时，禁食期限应严格控制，试验结果才有可比性。