动物细胞工程

3．动物细胞工程

动物细胞工程一般包括细胞培养、组织培养、养物的传代、无血清培养、养物的长期保存以及细胞组织培养污染的防治六个方面。

细胞培养。培养动物细胞一般步骤：首先无菌取出目的细胞所在组织，以培养液漂洗干净，以锋利无菌刀具割舍多余部分，切成小组织块；接下来将小组织块放置到解离液（含蛋白酶类，无钙、镁离子）中，离散细胞；最后低速离心洗涤细胞，将目的细胞吸取、转移到培养瓶培养。

组织培养。组织培养法与细胞培养法类似，主要区别在于省略了蛋白酶对组织的离析作用。其基本方法如下：首先无菌操作取出目的组织，以培养液漂洗；接着以锋利无菌刀具割舍多余部分，将该组织分切成1～2纳米小块，移入培养瓶，并加入合适的培养基浸润组织；再小心地将培养瓶平翻180°，搁置15～30分钟，以利组织块的贴壁生长；最后翻回培养瓶，平卧静置于37℃培养。

养物的传代。悬浮培养的细胞，只需定期将原培养细胞吸取、转移到新鲜培养基即可。

无血清培养。无血清培养基由于必须包括血清中的主要有效成分，它包括三大部分：①基础培养基，大多以DME培养基与HF12培养基等量混合为基础培养基；②基质因子包括纤粘素、血清铺展因子、胎球蛋白、胶原和多聚赖氨酸等；③生长因子、激素和维生素等约30种有机和无机微量物质，其中包括哺乳动物的绝大多数内分泌激素。

养物的长期保存。培养物的长期保存方法基本上有经典传代法和冷冻保存法两大类。卡瑞尔是经典传代法的创始人之一和杰出代表，他在极简陋的条件下每隔几天把鸡胚心肌细胞传代一次。在令人难以置信的长达34年的时间里成功地无菌传代3400次。

冷冻保存法具有操作简便、保存期长的特点。现以其中的液氮保存法为例简介如下：①将成熟培养物（细胞）与5%～10%的甘油或二甲亚矾混匀，封装于若干个安装瓶中；②缓慢降温（每分钟1℃～3℃）至－30℃；③继续降温（每分钟15℃～30℃）至－150℃；④转移至液氮冻存。可无限期保存。若安装瓶瓶置－70℃的环境下冷存，保活期通常只有几个月。在－90℃下培养物可保存半年以上。

细胞组织培养污染的防治。在进行细胞与组织培养的各个环节，都应如前所述十分重视灭菌与无菌操作，一旦发生染菌或交叉感染，抢救工作相当麻烦，而且还不一定能成功。

此外，细胞系株之间的交叉污染是一个值得重视的问题。一定要突出强调以下的规定：在一个工作区内不能同时放置两种以上细胞株，除非由于细胞融合等工作需要的暂时存放。同时，两种细胞株不能共用培养器具，即使器具消毒后也是如此。

总之，微生物污染与细胞株间的交叉感染是细胞、组织培养工作者必须时刻关注的问题。预防为主，防治结合是实验室工作的指导方针。