流感病毒基因组的提取

实验三　流感病毒基因组RNA的提取

一、实验目的

掌握从病毒中提取病毒基因组的方法。

二、实验原理

用强变性剂如异硫氰酸胍等溶液能够迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破坏，核蛋白的二级结构遭到破坏，从核酸上解离下来，同时RNA酶也可被强变性剂(如4mol/L异硫氰酸胍溶液)以及β-巯基乙醇等灭活。从而得到完整无损的RNA。

三、实验材料及器械

(1)收获的尿囊液(即流感病毒)。

(2)变性液2×Solution D、水饱和酚、氯仿、无水乙醇、无RNase的去离子水。

(3)高速离心机、tip头、Eppendorf管、微量加样器、干烤箱、紫外分光光度计。

四、实验步骤

1.取收获的尿囊液(即流感病毒)1ml，加入1ml变性液2×Solution D，振荡30s，加入等体积的水饱和酚，0.2体积的氯仿，振荡30s，加入0.1倍体积的2mol/L NaAc (pH4.0)，混匀。

2.冰浴约20min，4℃下12000g离心15min，取上清液，用酚/氯仿抽提两次，直至无蛋白层;取上清液，用氯仿再抽提一次。

3.取上清液，用2倍体积冰冷的无水乙醇沉淀，70%乙醇洗涤沉淀两次。

4.用无RNase的去离子水溶解RNA，紫外检测260nm、280nm、230nm波长的吸光光密度值，初步估算RNA的纯度及浓度， －20℃保存备用。

五、方法评注

研究基因的表达和调控时，需要从组织或细胞中分离纯化RNA。RNA质量的高低常常影响后继工作(如RT-PCR、cDNA库构建和Northern Blot等)的成败。RNA的提取围绕一条主线，即保护RNA的完整性，使RNA免受RNase的酶解。围绕这条主线，要关注RNase-Free工作环境的建立、RNase-Free条件的保持等系统的细节问题。

RNA提取物的完整性可通过电泳来检测。在有EB存在时，完整未降解的RNA制品电泳图谱应可清晰地看到18S rRNA、28S rRNA两条带，也应能看到一条较模糊的5S rRNA条带，且28S rRNA条带亮度应为18S rRNA的1.5～2倍。