植物组织中的提取

实验四　植物组织中DNA的提取

【实验目的】

1．掌握从植物组织中提取DNA的方法。

2．掌握从植物组织中提取DNA的原理。

【实验原理】

脱氧核糖核酸(DNA)是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核中，盐溶法是提取DNA的常规技术之一。从细胞中分离得到的DNA是与蛋白质结合的DNA，其中还含有大量RNA，即核糖核蛋白。如何有效地将这两种核蛋白分开是技术的关键。

CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)是一种去污剂，可裂解细胞膜，CTAB能与核酸形成复合物，在高盐溶液中(0．7 mol/L NaCl)是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度(0．3 mol/L NaCl)时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白、多糖类物质分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。因此CTAB法几乎成为富含多糖的样品(如细菌、植物)的基因组DNA抽提的首选方法。

【实验材料】

植物新鲜叶子。

【药品试剂】

1．研磨缓冲液:称取59．63 g NaCl，13．25 g柠檬酸三钠，37．2 g EDTA-Na分别溶解后合并为一，用0．2 mol/L的NaOH调至pH7．0，并定容到1000 ml。

2．10×SSC溶液:称取87．66 g NaCl和44．12 g柠檬酸三钠，分别溶解，混合后定容到1000 ml。

3．1×SSC溶液:用10×SSC溶液稀释10倍。4．0．1×SSC溶液:用1×SSC溶液稀释10倍。

5．氯仿-异戊醇:按24 ml氯仿和1 ml异戊醇混合。

6．5 mol/L高氯酸钠溶液:称取NaClO₄．H₂O70．23 g，先加入少量蒸馏水溶解，然后定容至100 ml。

7．SDS(十二烷基硫酸钠)。

8．1 mol/L HCl、0．2 mol/L NaOH、0．05 mol/L NaOH。

9．二苯胺乙醛试剂:1．5 g二苯胺溶于100 ml冰醋酸中，添加1.5 ml浓硫酸，装入棕色瓶，储存于暗处，使用时加0．1 ml乙醛液［浓乙醛∶H₂O=1∶50(V/V)］。

10．1 mol/L高氯酸溶液(HClO₄)。

11．100μg/ml DNA标准液:取标准DNA 25 mg溶于少量0．05 mol/L NaOH中，再用0．05 mol/L NaOH定容至25 ml，后用移液管吸取此液5 ml至50 ml容量瓶中，加5 ml 1 mol/L HClO₄，混合冷却后用0．5 mol/L HClO₄定容到刻度，则得100μg/ml的标准溶液。

12．2×CTAB提取缓冲液:100 mmol/L Tris-HCl(PH8)，20 mmol/L EDTA-Na₂，1．4 mol/L NaCl，2%CTAB(W/V)，1%PVP(聚乙烯吡咯烷酮)(W/W)，40 mmol/Lβ-巯基乙醇(相当于每100 ml加280μl，用前加入)。

【实验方法】

1．植物DNA的SDS提取法:

(1)称取植物幼嫩组织10 g剪碎置研钵中，加10 ml预冷研磨缓冲液并加入0．1 g左右的SDS，置冰浴上研磨成糊状。

(2)将匀浆液转入25 ml刻度试管中，加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，加上塞子，剧烈振荡30秒，转入离心管，静置片刻以脱除组织蛋白质。4000 r/min，离心5分钟。

(3)离心形成三层，小心地吸取上清液至刻度试管中，弃去中间层的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。

(4)将试管置72℃水浴中保温3分钟(不超过4分钟)，以灭活组织的DNA酶，然后迅速取出试管置冰水浴中冷却到室温，加5 mol/L高氯酸钠溶液(提取液:高氯酸钠溶液=4∶1，体积比)，使溶液中高氯酸钠的最终浓度为1 mol/L。

(5)再次加入等体积氯仿-异戊醇混合液至大试管中，振荡1分钟，静置后在室温下4000 r/min，离心5分钟，取上清液置小烧杯中。

(6)用滴管吸95%的预冷乙醇，慢慢地加入烧杯中上清液的表面上，直至乙醇的体积为上清液的两倍，用玻璃棒轻轻搅动。此时核酸迅速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上。

(7)加入0．5 ml 10×SSC，使最终浓度为1×SSC。

(8)重复第6步骤和第7步骤即得到DNA的粗制品。

(9)加入已处理的RNase溶液，使其最后的作用浓度为50～70μg/ml，并在37℃水浴中保温30分钟，以除去RNA。

(10)加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，在三角瓶中振荡1分钟，再除去残留蛋白质及所加RNase蛋白，室温条件下，4000 r/min，离心5分钟，收集上层水溶液。

(11)再按(6)、(7)步骤处理即可得到纯化的DNA。

2．植物DNA的CTAB提取法:

(1)称取新鲜叶片0．5 g，剪碎放入研钵中，在液氮中研磨成粉末。

(2)将粉末等量转移到加有1 ml经预热的2×CTAB提取缓冲液的4个1．5 ml离心管中，迅速混匀后置于60℃水浴中，温育60分钟。每隔15～20分钟摇匀一次。

(3)取出离心管，冷却至室温，10000 r/min，离心5分钟，弃沉淀。

(4)取上清液移至新管，加入加等体积氯仿/异戊醇(24∶1)混合液，充分混匀，室温下，10000 r/min，离心10分钟，弃沉淀。

(5)用一开口较大的枪头将上层水相转移至另一新的离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇。充分混匀，10000 r/min，离心10分钟。

(6)转移上清液至另一新的离心管中，加入2倍体积的100%乙醇或0．7倍体积异丙醇，充分混匀，可见出现絮状沉淀，－20℃放置30分钟或－80℃放置10分钟。

(7)10000 r/min，离心10分钟，弃上清液，回收DNA沉淀。

(8)沉淀用70%乙醇洗涤2次，再用无水乙醇洗涤一次。晾干或在超净工作台上吹干。

(9)将风干的DNA直接在4℃保存备用。或溶于50μl TE溶液中，加入1μl 10 mg/ml的RNase溶液，30℃水浴或室温1小时水解RNA，于－20℃保存。

【思考题】

核酸分离时为什么要除去小分子物质和脂类物质?本实验是怎样除掉的?