植物中的提取

实验十一　植物中RNA的提取

一、实验目的

掌握植物总RNA的抽提方法和基本原理，熟练掌握实验操作技术。提取的RNA可以用于RT-PCR以及Northern印迹分析。

二、实验原理

RNA存在于细胞质和细胞核中，所以，提取RNA时，首先将组织在液氮中研磨成粉状后，将粉转入含有蛋白质、膜变性剂如异硫氰酸胍的胍类试剂或去污剂如CTAB、SDS等破坏细胞结构，同时使蛋白与核酸分离，然后用酚、氯仿除去脂溶性成分，同时也能使蛋白质变性。在有机溶剂抽提时，不仅需要把RNA同蛋白质分离，也需要同DNA分离，在酸性条件下，DNA可以溶解在酚中和酚水交界处，RNA还在水相。因此需要把酚的酸度调低，使之小于pH7。水相中的RNA需要进一步被沉淀，从混合物溶液中进一步纯化出来。同DNA类似，在单价阳离子的酸性醇类(3倍体积无水乙醇/或等量异丙醇)溶液中，由于阳离子与核酸骨架上的磷酸根结合，使核酸分子之间的排斥力受到屏蔽，可以互相接近，同时由于在醇溶液中，核酸分子溶解性降低，从而沉淀出来。RNA沉淀中含有离子和有机溶剂。同DNA提取一样，也要用75％乙醇洗。

RNA酶到处都是，RNA极易降解。RNA酶生物活性非常稳定，在环境中灰尘、各种实验器皿和试剂、人体汗液、皮肤、唾液中都存在。这类酶耐热、耐酸、耐碱，煮沸不能使之失活，蛋白质变性剂只能使之暂时失活。RNA酶不需要辅助因子的作用。二价金属螯合剂对其活性无影响。防止RNA降解、抑制RNA酶生物活性是提取RNA过程中需要特别注意的事情。

防止外源性RNA酶污染的措施有:操作过程中戴手套，在洁净的环境中操作，玻璃器皿严格清洗后在180～200℃烘4h，其他塑料用品也用焦碳酸二乙酯DEPC浸泡过夜，处理后高压锅灭菌，使致癌物和变性剂DEPC分解成乙醇和水而失活、所有溶液用DEPC处理后灭菌，Tris-HCl用处理好的DEPC水配制，酚用处理好的DEPC水单独配制。

抑制内源RNA酶活性的物质有:皂土(bentonite)、复合硅酸盐(结合或吸附RNA酶)、DEPC、肝素、多胺、共聚酪氨酸-谷氨酸(抑制RNA酶活性);蛋白质变性剂(酚、氯仿)、蛋白酶K、阴离子去污剂(SDS、sarkosyl、DOC胆酸钠，高浓度KCl下形成SDS蛋白复合物沉淀)、解偶剂(胍类使蛋白质二级结构消失、核蛋白与核酸分离)。RNA酶的特异抑制剂(竞争性抑制)有Rnasin(在1mmol/L巯基乙醇下作用)、氧钒核糖核苷复合物。

DEPC:是很强的核酸酶抑制剂。与蛋白质中的组胺酸结合，使蛋白质变性。也与RNA或DNA单链反应，破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环，但这个活性需要的浓度比使蛋白质变性的浓度大100～1000倍。在Tris中分解成二氧化碳和乙醇，因此在0.1mol/L Tris-HCl，pH7.5溶液中极不稳定，半衰期只有1.25min。不能用聚苯乙烯器皿存放，保存在4℃或液氮。

甲醛使RNA三维结构破坏成为线性，便于在琼脂糖凝胶上电泳分离，吗啉代丙烷磺酸(MOPS)用做电泳缓冲液盐类，同时也使RNA酶变性，防止RNA降解的作用。

本实验采用CTAB的方法提取RNA。RNA电泳采用常规方法电泳。

三、实验仪器、材料和试剂

1.仪器:研钵，低温高速离心机，水浴锅，微量移液器，离心管(1.5mL、7mL)，枪头，电泳仪，电泳槽，烘箱。

2.材料:植物嫩叶。

3.试剂:

100mL CTAB提取缓冲液:2g CTAB，10mL Tris(1mol/L pH8.0)，4mL EDTA(0.5mol/L pH8.0)，8.16g NaCl。

氯仿-异戊醇(24∶1):先加96mL氯仿，再加4mL异戊醇，摇匀即可。

巯基乙醇，2mol/L pH4.0 NaAC，水饱和酚，3mol/L pH5.2NaAc，无水乙醇，75％乙醇，DEPC水，液氮，研钵。

四、实验步骤

实验准备:所有玻璃用品都提前一天在180℃烘4h。研钵用锡箔纸包好后烘，烘完以后放在－20℃保存备用。塑料离心管(1.5mL)和枪头在DEPC水中浸泡过夜后灭菌使DEPC失活。

(一)RNA提取详细步骤和说明

1.取0.6mL CTAB提取缓冲液，加入12μL巯基乙醇，于65℃预热。

2.在液氮中研磨0.2g样品，将研成粉末的样品加入预热好的抽提液中混匀，65℃反应10～40min。间或摇匀。

3.先加120μL2mol/L NaAC，pH4.0，再加水饱和酚0.6mL，混匀，再加120μL氯仿-异戊醇(可不加)。混匀后10000rpm离心15min。混合时不要剧烈振荡。

4.取上清液500μL用等体积酸酚/氯仿-异戊醇抽提。10000rpm离心5min。

5.取上清液用等体积氯仿-异戊醇抽提，10000rpm离心5min。

6.取上清液，加入1/10体积的3mol/L NaAC，pH5.2，1体积的异丙醇，冰上放置20～30min。

7.12000rpm离心20min，分别用75％和无水冷乙醇洗，每次加1mL后12000rpm离心5min。超净工作台上干燥。

8.沉淀用30μL灭活后的DEPC水溶。

(二)RNA提取流程图

图11-1　RNA提取流程图

五、结果与分析

总RNA电泳图谱一般都有28S、18S、5S三条核糖体蛋白特征带，中间分布着大大小小其他类型的弥散状带型(图11-2)。如果从加样孔开始一直到5S，有连续的亮带，说明有DNA污染。如果中间没有带，只有小分子带在下方，则RNA被降解了。

图11-2　CTAB法提取RNA电泳图

六、注意事项

1.实验前应将实验室地板拖干净，桌面用干净湿抹布和洗衣粉擦干净，手用肥皂洗干净。戴手套操作。操作台面用75％乙醇消毒。

2.研磨时快速准确，防止污染。

3.各个操作步骤中戴手套，并且防止空气污染，尽量在超净工作台酒精灯前操作。

4.微量移液器用75％酒精棉球擦净，每次取无菌离心管时用烧过的镊子取。

5.在开关离心管盖子时也尽可能用烧过的镊子操作，动作尽量快速准确。

6.在有机溶剂分相后取水相时不要取到底，DNA可能分布在水相与有机相交界处。

实验需要约6h。

七、思考题

实验中所用的各试剂的作用是什么?如:焦碳酸二乙酯(DEPC)，吗啉代丙烷磺酸(MOPS)，异硫氰酸胍，醋酸钠(NaAC)，氯仿，苯酚，甲醛，乙醇，乙二胺四乙酸(EDTA)，异丙醇。