免疫磁珠法分离淋巴细胞

实验三　免疫磁珠法分离淋巴细胞

实验目的

掌握免疫磁珠法分离淋巴细胞的基本原理，熟悉免疫磁珠法分离淋巴细胞的主要步骤和方法。

实验原理

免疫磁珠（immune magnetic bead，IMB）法分离细胞是基于细胞表面抗原能与连接有特异性单克隆抗体的磁珠相结合，可形成细胞－特异性单克隆抗体－磁珠复合物，在外加磁场中，该复合物通过磁珠被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞由于不能与连接特异性单克隆抗体的磁珠结合而没有磁性，因而也不能在磁场中停留，从而使细胞得以分离。

免疫磁珠法分离细胞主要有正选法和负选法两种方法。正选法即磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞，也称为淘洗法。负选法即磁珠结合不需要的细胞，游离于上清液的细胞为所需细胞。免疫磁珠法分离细胞所获细胞纯度可高达93%～99%，细胞获得率可达90%，活细胞率大于95%，且操作简单，无需离心沉淀过程，具有省时、简便、低廉等优点。下面就以免疫磁珠间接法分离淋巴细胞（正选法）为例介绍免疫磁珠分离细胞的方法。

实验材料

（1）连接有磁珠的二抗抗体，一抗抗体；

（2）含有0．2%BSA的PBS，含有1．2%BSA的PBS，含有30%FCS的PBS；

（3）磁架；

（4）玻璃管等。

实验方法

（1）取适量磁珠悬液，用20倍体积的PBS和0．2%BSA溶液重悬后，置磁架上5 min（磁珠与单个核细胞或全血的比例为：0．5mg磁珠/1×10⁷个单个核细胞或1mL全血）；

（2）吸去上清，以去除在储存过程中从磁珠上脱落的二抗。用100LPBS和0．2% BSA溶液重悬磁珠。加入一抗（一抗与磁珠的比例为：5g一抗/1mg磁珠），置于室温15 min，中间轻微晃动两次。再置于磁架上5min。

（3）加入2mL PBS和1．2%BSA溶液，再置于磁架上5min。吸去上清液，以去除未与二抗结合的一抗。重复操作一次。用100LPBS和0．2%BSA溶液重悬磁珠。

（4）用PBS和30%FCS调整待分离细胞的浓度为1×10⁷细胞/mL，将细胞加入磁珠悬液中，置于室温10min，中间轻微晃动一次。然后置于磁架上10min，吸去上清液。

（5）用完全培养基重悬磁珠结合的细胞后直接进行培养。

实验结果

（1）若采用负选法分离细胞，磁珠与细胞比例为：1mg磁珠/1×10⁷单个核细胞或1 mL全血。

（2）待分离的细胞悬液应尽量是单细胞悬液，避免细胞黏附成团，以免影响分离效果。

注意事项

在选择正选法或负选法时，主要考虑分离成本，对目的细胞纯度和活性的要求等。一般负选法成本较高、分选过程更复杂，但获得目的细胞的纯度更高，对细胞活性的影响也更小。

思考题

本实验如采用负选法，对一抗抗体和二抗抗体的要求有何不同？