双抗体夹心法测

实验一　ELISA：双抗体夹心法测HBsAg

ELISA是将已知抗体或抗原结合到固相载体的表面，并保持其免疫活性，并将已知的游离抗体或抗原与酶连接，形成酶标抗体或抗原，该酶标抗体或抗原分别保持其免疫活性和酶活性。测定时，在固相载体上按照一定的步骤加入待测抗原或抗体及酶标抗体或酶标抗原，酶标抗原或抗体与相应抗体或抗原反应后，洗去未结合的游离物质，结合在免疫复合物上的酶遇到相应的底物时，可以催化底物的水解、氧化或还原，从而产生有色物质，颜色的深浅与待测物质含量具有相关性。常用的酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）等，酶催化的底物常为四甲基联苯胺（TMB）和邻苯二胺（OPD）等。根据检测目的和操作步骤的不同，分为双抗体夹心法、间接法及竞争法等。

ELISA双抗体夹心法是检测大分子抗原的常用方法。即用抗体包被固相载体，加入待检标本，标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，洗涤后再加入酶标抗体，形成抗体－抗原－酶标抗体双抗体夹心复合物，洗涤后加底物显色，颜色的深浅与相应抗原的量呈正相关。

上述方法也可改为双位点一步法。该法是针对抗原分子上两个不同且空间距离较远的表位的两种单克隆抗体，即包被使用一种单克隆抗体，酶标记使用另一种单克隆抗体。测定时将含待测抗原的标本和酶标抗体同时加入进行反应，两种抗体互不干扰，经过一次温育和洗涤后，即可加入底物进行显色测定。

实验目的

本实验以ELISA双抗体夹心法（双位点一步法）测HBsAg为例，要求如下。

（1）掌握用ELISA检测病毒抗原/抗体的原理及用途。

（2）了解其实验方法及结果判定原则。

实验原理

以特异性的抗体（抗－HBs单克隆抗体）包被载体表面，然后加入可能含有相应抗原的待测血清，孵育后洗涤，再加辣根过氧化物酶标记的特异性抗体（HRP标记抗－HBs）一起孵育。包被的抗体、待检抗原和酶标抗体形成夹心式复合物。洗去未结合的物质，加入底物显色，根据颜色的有无或深浅，定性或定量地检测抗原（HBsAg）。本法适用于乙型肝炎的临床辅助诊断、献血员筛选及乙肝患者的疗效观察。

实验材料

（1）商品化乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）检测试剂盒。

①抗－HBs单克隆抗体包被微孔反应板（48孔）。

②HRP标记抗－HBs（测HBsAg酶结合物）。

③底物液：四甲基联苯胺（TMB）。

④显色剂：H2O₂。

⑤洗涤液：20×磷酸盐缓冲液（含2%Tween－20）。

⑥终止液：2mol/L硫酸。

⑦HBsAg阳性对照。

⑧HBsAg阴性对照。

⑨板贴。

（2）自备材料：微量移液器，吸水纸，蒸馏水，吸头，温箱及酶标检测仪等。

实验方法

（1）打开试剂盒，用蒸馏水将洗涤液进行20倍稀释，即工作液，充分摇匀后备用。

（2）取出包被板，做好标记，留二孔做空白对照，其余加入阳性对照二孔、阴性对照三孔各50μL（或1滴/孔）；于相应的反应孔内加待测标本，50μL/孔（每份标本应做两个复孔）；随即加入HRP标记抗－HBs，50μL/孔（或1滴/孔）。振荡混匀后，贴上板贴，置于37℃温箱中孵育30min。

（3）撕下板贴，用洗涤液手工洗涤（手工洗板时，应先弃去各孔内液体，在吸水纸上拍干，用洗涤工作液注满各孔，防止串孔，约350μL/孔，停留5～10s后弃去，如此反复洗涤5次，每次均拍干）。或在自动洗板机上用稀释好的洗涤液连续洗涤6次，每次3min，最后一次拍干。

（4）加入底物液50μL/孔（或1滴/孔），随即加入显色剂，50μL/孔（或1滴/孔），充分混匀，置于37℃处避光孵育10min。

（5）加终止液，50μL/孔（或1滴/孔），轻轻振荡混匀后，立即测试结果。

（6）在全自动酶标仪上以空白孔调零（450nm波长），测定各孔的OD值。

实验结果

（1）结果有效性：阴性对照孔OD值应小于0．l，阳性对照孔OD值减阴性对照孔OD值应大于0．6，否则应重新进行实验。

（2）CUT OFF值计算：CUT OFF值＝2．1×阴性对照孔平均OD值（阴性对照孔OD值小于0．05时，应按0．05计算）。

（3）待测样品的OD值≥CUT OFF值者，判为HBsAg阳性，否则为阴性。

注意事项

（1）操作前请仔细阅读说明书，严格控制反应的温度、时间。

（2）试剂盒应置于室温平衡30min以上。包被板条需放入有干燥剂的密封袋中保存。不同批次试剂组分不得混用，板贴不得反复使用。

（3）待检样品为血清或血浆，无溶血无污染，正常检测时，样品可放置于2～8℃处，超过48h，应放置于－20℃处保存，检测时应摇匀，并防止反复冻融。待测标本勿用NaN₃防腐。

（4）手工洗板时应避免孔内液体外溢，以防止相邻孔相互污染而造成假阳性。

（5）浓缩洗涤液若有结晶时，请于37℃条件下溶解后再稀释使用。

（6）实验过程中操作人员应注意防护，实验废弃物应按传染性样品处理。

（7）实验终止后在20min之内测定结果方为有效。

思考题

（1）如何避免ELISA双位点一步法出现“钩状效应”？

（2）简述检测血清HBsAg的临床意义。