血管平滑肌细胞的收缩应激性增高

尽管内皮细胞结构和功能的紊乱在冠状动脉痉挛的发病机制研究中获得了众多的证据，但有些问题仍然无法得到合理的解释。例如：冠状动脉痉挛通常发生在合并有动脉硬化斑块的局部血管，而内皮功能的紊乱常常导致广泛的心外膜血管和体内其他血管的功能障碍。在冠状动脉痉挛患者中，对缓激肽和P物质的舒张反应仍然十分明显，而对这两种物质的反应是明显依赖于正常的内皮功能的。长期给予改善内皮功能的药物（不饱和脂肪酸和鱼油等）并不能改善冠状动脉痉挛的发作。另外，如果内皮功能紊乱是冠状动脉痉挛发作的唯一因素，那么在发病率更高的亚洲人群中，其内皮功能紊乱程度或发生率应明显高于冠状动脉痉挛发病率低的西方人群，但在临床研究中，并没有发现类似的证据。这些都提示，内皮细胞结构和功能的紊乱并不是冠状动脉痉挛唯一的发病机制。Shimokawa等提出了冠状动脉痉挛发病机制的另一学说——血管平滑肌细胞的收缩应激性增高。

钙离子是体内重要的第二信使，是平滑肌收缩的激活信号，当胞质中钙离子达到激活浓度时，便与钙调蛋白（calmodulin，CaM）结合，继而再与肌球蛋白轻链激酶（myosin light chain kinase，MLCK）结合为三元体，活化的MLCK使肌球蛋白头部轻链发生磷酸化，形成磷酸肌球蛋白，并激活其上的Mg2＋－ATP酶使之分解ATP产生能量令横桥滑动，产生平滑肌的收缩。肌球蛋白轻链（myosin light chain，MLC）的磷酸化水平是其中重要一环，MLC除了受到MLCK的影响外，还受到肌球蛋白轻链磷酸酶（myosin light chain phosphase，MLCP）的双重调节。MLCK磷酸化MLC导致平滑肌收缩，而MLCP则起到了抑制作用，导致MLC的磷酸化和平滑肌的收缩进一步增强，即增加了收缩或调节装置对钙离子的敏感性，这种现象被称之为“钙敏化”。然而，研究钙敏化在冠状动脉痉挛发病机制中的作用却十分不易，因为我们很难取得冠状动脉痉挛患者局部的活体标本。近年来，人们从动物实验中，证实了RhoA及其底物Rho激酶（Rho kinase，ROK）与钙敏化的关系。RhoA是小G蛋白超家族中Rho家族的一个亚族成员，含有GDP／GTP结合区和GTP酶活性区，在GDP结合失活状态和GTP结合激活状态之间循环。ROK是RhoA的下游效应器，有两种异构体。RhoA的作用主要是通过ROK实现的。活化的ROK能使肌球蛋白结合亚单位磷酸化，使MLCP失活。同时，在体外，ROK也能直接磷酸化MLC。在血管平滑肌中加入活性ROK或ROK的催化亚单位，可以引起明显的MLC磷酸化继而引起平滑肌的收缩。一般情况下，对钙敏化起调节作用的主要是ROK介导的MLCP的失活。ROK还促进了纤溶酶原激活剂抑制物－1、增强了内皮细胞的通透性、促进了单核细胞的迁移和平滑肌细胞的增殖。

Shimokawa及其研究团队利用白介素1β（IL－1β）对小型猪的冠状动脉进行包被和处理，并给予高胆固醇膳食喂养，建立猪的冠状动脉痉挛模型。研究发现，小型猪冠状动脉痉挛处的RhoA－ROK在mRNA水平和蛋白质水平有明显的高表达，其分子活性水平有了明显的提高。RhoA－ROK在血管平滑肌中的高表达，高度提示其与冠状动脉痉挛的相关性。如果在冠状动脉痉挛模型动物中给予注射ROK的抑制药——法苏地尔，则可以发现冠状动脉痉挛的发作明显减轻。Masumoto等在临床研究中也发现了类似情况。他们研究了20例乙酰胆碱激发试验呈阳性的冠状动脉痉挛患者，分别给予盐水和法苏地尔冠状动脉内注射后，再次行乙酰胆碱试验。结果发现注入生理盐水的患者，再次出现了同样程度的冠状动脉痉挛，而在法苏地尔组，乙酰胆碱诱发的冠状动脉痉挛明显减轻，并且没有出现明显的胸痛症状和ST段的缺血性改变。法苏地尔的使用也并没有造成全身血流动力学的改变。Kandabashi在人离体动脉模型中也发现，剥脱了内膜的冠状动脉旁路移植术患者的离体内乳动脉，如果给予法苏地尔，则可以明显抑制血清素诱发的血管痉挛反应。关启刚、曾定尹等也做了类似的研究，在由IL－1β诱导的小型猪冠状动脉痉挛模型中，测定冠状动脉包裹血管段ROK的mRNA表达、肌球蛋白结合亚基磷酸化表达及光镜病理学改变。结果发现在冠状动脉外膜包裹IL－1β血管段发生不同程度的管腔狭窄，5－羟色胺可诱发病变血管段痉挛。模型组与对照组相比，ROK的mRNA表达水平在病变血管段明显上调（98．20%±7．66%∶63．70%± 4．26%，P＜0．05），肌球蛋白轻链磷酸酶的肌球蛋白结合亚基磷酸化表达也明显升高（25485±4745∶6510±779，P＜0．05）。光镜下可见病变血管段内膜增殖及炎症细胞聚集现象，证实ROK参与冠状动脉痉挛的发生。最近的一些研究也表明，内皮型NO合酶也受到了RhoA－ROK途径的调节。临床上常用的他汀类药物，通过阻止RhoA－ROK途径，促使内皮型NO合酶水平的上调和激活，减轻了冠状动脉痉挛的发生。而直接的RhoA－ROK途径的抑制，也可以明显增加内皮型NO合酶的表达。因此，RhoA－ROK途径与体内NO的活性密切相关，也间接参与冠状动脉痉挛的发生。

ROK有两种异构体：ROKα和ROKβ，也称作ROCK1和ROCK2。ROCK2更多的在心血管和脑血管表达。近期，韩国学者Sang－Yong Yoo报道了ROCK2的基因多态性与冠状动脉痉挛的关系。他们采用高分辨熔解方法（high resolution melting，HRM）对106例冠状动脉痉挛患者和107例正常对照者进行了5个SNP的研究，分别是rs978906、rs2271621、rs2230774、rs1515210和rs3771106。结果发现，两组的这5个候选SNP的基因型分布无统计学差异，但在单体型的分析中，GT－C－T－G的单体型（依次由rs978906、rs2271621、rs2230774、rs1515210和rs3771106组成）为保护型，该单体型的存在与冠状动脉痉挛发病率下降有明显关系。Kamiunten在日本冠状动脉痉挛人群中发现了一个新的错义突变G930T（K310N），该等位基因在冠状动脉痉挛人群中的频率明显高于正常人群。在同时进行的对高加索人群的研究中，却没有发现此种基因型变化。在用蛋白质印迹法进行的功能学研究中，转染了突变型ROCK2基因的细胞在给予缓激肽刺激后，其ERM（一种细胞骨架—膜连接蛋白）的磷酸化水平明显增加，而转染野生型ROCK2基因的细胞则没有发生类似变化。这些说明，RCOK2基因的多态性可以部分解释冠状动脉痉挛的遗传异质性，也可能是RhoA－ROK途径诱导的冠状动脉平滑肌高反应性的原因之一。另外，日本学者Takefuji还报道了Rho家族中ARHGAP9的基因突变rs11544238（Ala370Ser）与冠状动脉痉挛有一定关联。

Rho激酶抑制药——法苏地尔最早被用来治疗蛛网膜下腔出血术后的脑动脉痉挛，也对造影正常的微血管心绞痛患者及劳力性心绞痛有效。目前的基础和临床研究提示Rho激酶抑制药在减轻和消除动脉粥样硬化斑块和冠状动脉痉挛的治疗中有一定的应用前景。由于其存在一定的肝功能损害的不良反应和其他一些原因，尚未广泛应用于临床实践。

除了RhoA－ROK途径介导的平滑肌性收缩外，蛋白激酶C（PKC）途径也参与了其中的调节。佛波醇二丁酯（PDBu）是PKC的特异型激活剂，研究发现，PDBu诱导的平滑肌的持续收缩中并没有检测到GTP·RhoA的增加，说明其诱导的收缩是不依赖于RhoA的。PKC通过特定的靶位置磷酸化细肌丝相关的蛋白（包括Calponin和Caldesmon蛋白），使肌动蛋白ATP激酶的活性增强，平滑肌细胞收缩。体外实验也表明，PKC介导的MLC磷酸化导致了平滑肌的收缩反应。而在体内，PKC首先激活MLCK，然后磷酸化MLC引起胞内钙增加及平滑肌的收缩。动物模型中PDBu可以直接诱发冠状动脉痉挛，而其抑制药十字孢碱和鞘氨醇则可抑制冠状动脉痉挛发生，进一步证实了PKC与冠状动脉痉挛的密切关系。PKC有α、β、δ、ζ4种异构体，每一种异构体从细胞内向膜转位的程度是该酶活性的标志，但Tadashi等用Western印迹分析显示痉挛血管部位仅有PKC－δ从细胞内向膜转位。然而Dallas等报道PKC家族有钙离子依赖性和钙离子非依赖性异构酶，PKC－ζ和PKC－α分别通过钙离子依赖性和钙离子非依赖性途径诱导冠状动脉平滑肌收缩。PKC－β在冠状动脉痉挛中有无作用尚未见报道。实际上，PKC和Rho激酶共存于同一信号通路，PKC位于Rho激酶之前，Rho／Rho激酶介导的通路是冠状动脉痉挛产生的基本途径，但可以被PKC的活动调节，PKC是Rho／Rho激酶活性的上位调节剂。Rho激酶抑制药能明显抑制但不能终止PDBu诱发的收缩，提示PKC介导的细胞内信号传导通路除了调节Rho激酶通路外还调节了多个传导通路。CPI－17是另一个PKC依赖调节剂，它不存在于Rho激酶通路，这就可以解释单纯Rho激酶抑制药不能完全抑制PDBu诱发的收缩。

还有一条引起平滑肌收缩的经典途径是钙调素途径。目前公认的引起平滑肌收缩的主要机制是在钙离子的参与下，MLCK催化肌球蛋白轻链磷酸化，从而分解足量的ATP，肌球蛋白再与肌动蛋白产生相互作用，发生收缩。MLCP与MLCK的作用相反，能使肌球蛋白20kDa轻链（MLC20）脱磷酸化，当细胞内的钙离子浓度下降，MLCK失去活性后，肌球蛋白与肌动蛋白相互解离，平滑肌发生松弛。因此，平滑肌的收缩依赖于细胞内钙离子浓度的升高。MLCK是调节平滑肌收缩的关键酶。通常情况下，在钙离子和CaM存在时，可增加肌球蛋白Mg2＋－ATP酶活性，使肌球蛋白与肌动蛋白之间发生相互作用，引起肌肉收缩，这是调节平滑肌收缩的经典途径。因此，钙离子的转运异常也极有可能是引起血管平滑肌异常收缩从而导致冠状动脉痉挛的原因之一。临床上常用的钙离子拮抗药对冠状动脉痉挛有良好的效果也间接支持这一推测。细胞内外钙稳态的调节主要依赖电压依赖性钙通道（voltage－dependent calcium channels，VDCC），这提示着冠状动脉痉挛也可能是一种离子通道病。其中，起主要作用的是L型钙通道。L型钙通道的主要功能单位是α1亚单位，由α1C、α1D、α1S、αlF构成，其中α1C为高电压激活L型钙通道的CaV1．2亚型，参与平滑肌收缩机制。平滑肌肌质网不发达，其收缩依赖的细胞内钙离子浓度的增加主要来源于胞外，当细胞外钙离子浓度降低到一定程度，其收缩几乎完全停止。CaV1．2分布于平滑肌肌膜，当去甲肾上腺素（noradrenaline，NA）与肌膜上α受体结合，激活磷脂酶C型G蛋白，进而激活PLC，水解磷脂酰肌醇二磷酸（IP2），生成三磷酸肌醇（IP3）和三酰甘油，IP3可激活肌质网上的IP3受体促进内源性钙离子的释放，后者又可激活PKC，使平滑肌CaV1．2磷酸化而激活，造成细胞外钙离子大量内流，内流的钙离子与CaM结合形成复合物激活MLCK，从而进一步引发平滑肌的收缩。Halawa等发现变异型心绞痛患者淋巴细胞的跨膜钙离子转运增加。与此同时，日本学者Kuga在损伤冠状动脉内膜的猪动物模型的血管平滑肌细胞上（而非冠状动脉痉挛模型）发现L型钙通道表达增加，上述研究均提示钙离子通道在冠状动脉痉挛发生中可能起一定的作用。日本学者和国内向定成等也发现三种不同的钙拮抗药对冠脉痉挛的治疗效果存在差异，提示冠状动脉痉挛患者可能存在钙通道活性异常。但其详细的钙离子作用机制尤其是在冠状动脉痉挛患者中是否同样存在L型钙通道的活性增强尚不清楚。目前发现钙通道表达活性的增强、减弱与编码钙通道基因的多态性有关，主要研究领域集中在神经系统疾病中，而钙通道基因多态性与冠心病，特别是冠状动脉痉挛的研究尚未见相关报道。易绍东、向定成等对与血管平滑肌细胞收缩密切相关的L型钙离子通道和受体操纵钙通道的基因多态性做了初步分析。发现L型钙通道的β1调节亚基CACNB1基因rs523516位点的等位基因A与T在冠状动脉痉挛组和健康对照组之间的分布存在显著差异，而L型钙通道的主要功能单位α亚基C单位基因CACNA1C和受体操纵钙通道基因RYR2的标签SNP暂未发现两组的分布存在异常。这些都提示L型钙通道并非是参与冠状动脉痉挛发生的唯一离子通道，离子通道与血管平滑肌细胞高反应性的相关性十分复杂，仍有待进一步进行更全面和更深入的分析与研究。