荧光波长和激发光波长

传统荧光免疫分析受到散射光、样品的背景荧光和荧光淬灭等因素的干扰，分析灵敏度较低。而时间分辨荧光免疫分析(time－resolved fluorescence immunoassay，TRFIA)弥补了这一缺陷。

TRFIA的原理是利用镧系元素结合有机配体形成三价离子态时，在特定波长的紫外线激发下，从基态跃迁到高能态，经200 us的固定时间延迟，返回基态时发射特定荧光。用时间分辨荧光分析仪测定免疫反应最终产物的荧光强度。然后根据荧光强度和相对荧光强度的比值，判断反应体系中分析物的浓度，从而达到定量分析的目的。

目前用于TRFIA法的三价镧系离子主要包括:铕(Eu，Ar=151.96)、铽(Tb，Ar=159.2)、钐(Sm，Ar=150.43)、镝(Dy，Ar=162.5)等，利用双功能螯合剂异硫氰酸苯甲基－EDTA或二乙烯三胺五乙酸－DTPA等可将这些镧系离子和蛋白质分子中的游离氨基连接起来。其中，在以上介绍的镧系离子中，铕离子Eu最为常用。

图7－9　荧光素的激发光谱(a)、发射光谱(b)及340 nm波长激发下抗血清的荧光光谱(c)

TRFIA法作为一种较为新型的荧光免疫分析技术，具有以下优点:

(1)荧光光谱独特。如图7－9所示，激发光光谱带宽，激发最大波长为300～500 nm，有利于增高激发能，从而增加标记物的比活性;发射光光谱带很窄，甚至不到10 nm，有利于降低本底，提高分辨率;同时可以使用615±5 nm滤光片，排除其他波长荧光的干扰。

(2)Stokes位移大，可高达250～350nm，最大程度地排除了非特异性荧光背景的干扰。如Eu3+与螯合剂β－萘甲酰三氟丙酮(β－NTA)形成的螯合物Eu3+－β－NTA，激发光最大波长可达340 nm，而发射光最大波长为612 nm，stokes位移为272 nm(图7－10)。

(3)荧光寿命长。一般镧系元素螯合物的荧光衰变时间为60～900μs，常用的Eu3+荧光衰变时间为714μs，而普通荧光免疫分析中的荧光团的荧光衰变时间只有约1～100μs。延迟测量时间，待背景荧光完全衰减后测定，所测得的便是标记物的特异性荧光，从而消除了蛋白质背景荧光的干扰。

(4)标记物稳定，可以保存1～2y，克服了同位素以及酶标等不稳定的缺点。由于稀土元素标记物体积小，标记后不会影响被标记物的空间立体结构，既保证了被检测物质的稳定性，又可实现多位点标记。

图7－10　Eu3+－β－NTA的激发光谱(a)以及发射波长(b)

总之，由于TRFIA法巧妙地利用了波长和时间分辨两种技术测量荧光，有效地屏蔽了由血清等生物物质产生的荧光，降低了本底，与RIA和EIA相比，TRFIA具有更好的特异性和精密度，同时稳定性好，具有很好的市场前景。